Outils biologiques h

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Outils biologiques hématologiques

• 1) Morphologie
• 2) Cytométrie en flux
• immunophénotype
• cycle cellulaire
• 3) Cytogénétique conventionnelle et moléculaire
• 4) Biologie moléculaire

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1) Morphologie

• Frottis sanguin
• myélogramme
• cytochimie

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2) Cytométrie en flux

• Technologie permettant de faire défiler des
  cellules à grande vitesse dans le faisceau d un
  laser
• la lumière ré émise (diffusion ou fluorescence)
  permet de classer la population suivant
  différents critères et de les trier
• la lumière diffusée renseigne sur le contenu de
  la cellule (granularité)
• la lumière absorbée proportionnellement au
  diamètre de la cellule (taille)
• la fluorescence est apportée par un fluorochrome
  qui absorbe l énergie du laser et émet une
  fluorescence dans une longueur d onde différente
• fluorochrome avec affinité pour l ADN (contenu
  en ADN)
• fluorochrome fixé sur un anticorps

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Cytomètre en flux

• De 1 à 8 Ac incubés avec les cellules

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Applications de la cytométrie en flux 1)
immunophénotypage

• Couplage d un fluorochrome sur un Ac
• si l  Ac se fixe sur une cellule mise en
  évidence de l expression de l antigène
• il existe une batterie de fluorochromes émettant
  à des longueurs d onde différentes (couleurs)
• les analyseurs peuvent étudier jusqu à 8
  couleurs simultanément, donc 8 marqueurs
  potentiellement
• permet de déterminer la densité antigénique à la
  surface (ou intracytoplasmique) des cellules

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Spécificité des marqueurs

• Marqueur pan-leucocytaire CD45
• cellules immatures CD34, CD117, HLA-DR, TdT
• cellules myélo/monocytaires CD13, CD33, CD11b,
  CD15, CD65
• lignée plaquettaire CD4, CD61, CD42b
• lymphocytes B CD19, CD20, CD22, CD10
• plasmocytes CD38, CD138
• lymphocytes T CD3, CD4, CD8, CD5, CD2, CD7
• cellules NK CD16, CD56, CD57

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• Permet le diagnostic des formes pour lesquelles
  la morphologie seule est insuffisante
• cellules indifférenciées (blastes)
• cellules lymphoïdes (score de Matutes)
• appartenance à une lignée
• Évalue le degré de différenciation cellulaire
• diagnostic des HPN (expression CD55 et CD59 sur
  GR et PN)
• étude des sous-populations lymphocytaires (CD4 /
  CD8)
• sensibilité 1/1000 maladie résiduelle
• recherche des cibles thérapeutiques
• rituximab Mabthera (anti-CD20)
• Alembtuzumab Campath (anti-CD52)
• gemtuzumab (anti-CD33)

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Exemple d une leucémie lymphoïde chronique
CD5 CD19 kappa
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Applications de la cytométrie en flux 2) Contenu
en ADN

• Utilisation de précurseurs fluorescents des bases
  nucléaires s'incorporant dans le DNA
• 5-bromo-deoxyuridine ou BrdU
• 5-iodo-deoxyuridine ou IdUrd

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Cytogénétique

• Conventionnelle caryotype
• moléculaire
• FISH
• multi-FISH
• peinture chromosomique

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Cytogénétique 1) Caryotype

• réalisé sur sang, moelle ou ganglion
• mise en culture de léchantillon en milieu
  nutritif (avec ou sans agents mitotiques)
• durée variable 24H ou 48H, parfois 72H
• blocage des métaphases
• choc hypotonique des cellules éclatement de la
  membrane nucléaire
• fixation étalement sur lame, coloration et
  analyse au microscope bandes chromosomiques
• au moins 20 métaphases analysées

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ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES LEUCEMIES
REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES (DE L'ADN)
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CONSEQUENCES MOLECULAIRES DESREMANIEMENTS
CHROMOSOMIQUES MODIFICATION DE GENES CIBLES
gtACTIVATION D'ONCOGENES gtINACTIVATION DE GENES
SUPPRESSEURS DE TUMEUR -(ANTIONCOGENES)
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2) Cytogénétique moléculaireFISH

• Hybridation in situ fluorescente (FISH)
• Visualisation de la région chromosomique couverte
  par la sonde
• à l échelle d un gène (qq dizaines de
  kilobases)
• à l'échelle d un chromosome peinture
  chromosomique
• plusieurs couleurs possibles permet de mettre en
  évidence des anomalies précises au niveau
  génomique ex bcr-abl

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Caryotype (cytogénétique conventionnelle)
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IGH/MALT1 t(1418)(q32q21)
IGH/CCND1
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Peinture chromosomique
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Multi-FISH
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Outils moléculaires PCR

• PCR standard

• PCR quantitative

sonde fluorescente
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Place des analyses moléculaires

• A la différence du caryotype, chaque PCR ne
  détecte qu une et une seule anomalie
• intérêt pas tant sur le diagnostic
  (cytogénétique) que sur le suivi maladie
  résiduelle
• problème plusieurs centaines danomalies
  caractérisées
• PCR développées sur les anomalies les plus
  fréquentes
• examens guidés par les données de la
  cytogénétique (partenaires de MLL par ex)

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Fin du diaporama, des exemples suivent
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Hémopathies lymphoides chroniques
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1) Hémopathies chroniques lymphoïdes B
Tous ont réarrangé leur Ig anomalies spécifiques
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• Identification du réarrangement clonal IgH
• Différentes familles de segments V
• Différentes familles de segments J
• Plusieurs types de PCR nécéssaires (séquences
  consensus)
• variabilité clonale (mutations)
• absence de détection (10)
• Perte du clone pendant lévolution

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LNH du manteau et expression de la cycline D1

• Non exprimée dans les lymphocytes normaux
• Conséquence moléculaire de la t(1114)(q12 q32)
  (70 des cas au caryotype)
• Non spécifique du lymphome du manteau
• Leucémie Prolymphocytaire B
• Myélome
• SLVL

Sa positivité (taux significatifs) élimine le
diagnostic de LLC
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Hémopathies lymphoïdes chroniques T Détection
des RR du TCR

• Chronologie des réarrangement TCR
• TCRg , d puis TCRb, TCRa en dernier
• Stratégies diagnostiques biologique
• Détection RR g et d
• Détection dun clone T (minoritaire)
• faux positif?
• Clone Réactionnel?
• Faible variabilité (V gamma du sujet agé)

Pas de translocations analysables par PCR
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Intérêt de la bio. mol. au diagnostic

• 1) mise en évidence d une anomalie génétique
• en cas de classification difficile
• Mise en évidence dune translocation spécifique
• IgH-Bcl2, NPM-ALK,
• Détection de lexpression anormale dun gène
• CCND1
• Point de départ pour létude de la maladie
  résiduelle
• 2) étude de la clonalité lymphoïde
• Étude du profil des réarrangements IgH/TCR
• doute sur une hyperplasie réactionnelle
• pathologies inflammatoires

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Syndromes myéloprolifératifs

• LMC
• Splénomégalie myéloïde
• Maladie de Vaquez
• Thrombocytémie essentielle
• LMMC

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Leucémie myéloïde chronique

• t(922)(q34q11) fusion entre extrémité 5 de
  BCR et 3 dABL
• Points de cassure
• dans ABL intron 1 ou 2
• dans bcr
• M-bcr p210 (b2a2 b3a2)
• m-bcr p190 (e1a2)
• µ-bcr p230 (e19a2)
• Récemment
• p200 (e8-int-a2)

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Utilité de la biologie moléculaire dans la LMC

• Diagnostique (/-) dans les formes complexes
• SMP atypique cytologiquement
• Phi masqué (CG conventionnelle)
• Pronostique quantification
• cinétique de disparition du transcrit
  pronostique?
• Maladie résiduelle
• nouvelles thérapeutiques (STI)
• greffes

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Bio. Mol des autres syndromes méloprolifératifs

• Pas de marqueur clonal (cellules non lymphoïdes)
  ltgt nouveau marqueur JAK2
• gt90 des polyglobulies primitives
• 50 de TE et des MF
• Analyse de l inactivation de l X peu (pas)
  employée
• techniques lourdes
• réalisables uniquement chez la femme
• démontré dans 70 des cas de SMP
• faux positifs 25-50 des femmes agées

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Leucémies aigues

• Lymphoblastiques
• Myéloblastiques

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LA myéloblastiques

• Classification WHO
• anomalies récurrentes translocations
• t(1517) (PML RARA) 5 - 8 / (LAM3)
• t(821) (AML1- ETO) 5 - 12 / (LAM2)
• inversion du 16 (CBFb-MYH11) 10-12 (LAM4)
• anomalies du 11q23 MLL 5-6 (LAM0-5)
• Autres classification FAB
• dysplasie
• LA de lignée ambiguë

RT-PCRs spécifiques développées
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LA lymphoblastiquesanomalies chromsomiques
(oncogéniques)

• LAL-B
• t(922) BCR-ABL
• t(411) AF4- MLL
• t(5,14) IL3-IgH
• LAL-T
• HOX11 / HOX11L2
• TAL deletion, SIL-TAL
• CALM-AF10

• t(119) E2A-PBX1
• t(814) cMyc-IgH
• t(1221) ETV6-AML1
• t(1114) LMO1/2
• t(17) LCK
• Inv14 TCL1

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LA lymphoblastiques réarrangement clonal du
récepteur à l Ag

• Lignée lymphoïde
• B réarrangement IgH
• T réarrangement TCR
• Réarrangements illégitimes
• Lignée B réarrangements TCR
• Marqueurs de clonalité, en dehors (ou en plus)
  danomalies détectables

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Clonalité lymphoïde et LAL
Clonalité TCR

• Pas dintérêt diagnostique mais identification au
  diagnostic
• Suivi maladie résiduelle quantification
• Genescan
• RQ-PCR
• Protocole GOELAL pilote
• Décisionnel à 10-3

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(No Transcript)