Elementos de Microscopia e Microan

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Elementos de Microscopia e Microanálise

• Docente Profª Drª Maria Tercília V. A. Oliveira
• Discente Bruna Victorasso Jardim

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• CULTURA CELULAR

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Definição

• Conjunto de técnicas que permitem cultivar
  células fora do organismo dadas as condições
  apropriadas

Humanos Animais Vegetais
Tecidos
IN VITRO X IN VIVO
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Histórico
Cultivou células de embrião de aves e, solução
salina aquecida
Wilhen Roux - 1885
Pioneiro no cultivo celular de animais
Ross Harrison - 1907
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• Hipótese Doutrina do neurônio

Origem do axônio - cada fibra nervosa é o produto
de uma única célula nervosa e não da fusão de
várias.

• fragmentos de tecido da medula espinhal de
  anfíbios
• linfas coaguladas como meio de cultura
• armazenadas em câmara úmida e morna
• microscópio intervalos regulares de tempo
• células nervosas individuais com um axônio cada

Base para a cultura celular
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1ª limitação
Desenvolvimento de meios nutritivos

• Burrows 1910

Plasma de aves ? nutrir explantes de tec.
embrionário

• Subculturas para prolongar a vida das células
• utilizando meio nutritivo

Plasma Extratos de embrião
Alexis Carrel

• Rous e Jones - 1916

Tripsina para dissociar células embrionárias
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2ª Limitação
Contaminação
Desenvolvimento de condições assépticas -
Cultivou células de embrião de aves por de 30
anos
Células dividiam indefinidamente ? extrato de
embrião de galinha
Alexis Carrel - 1913
1940 -
1940 - Surgimento dos antibióticos
Avanços com alguns destaques
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1ª linha celular contínua
Células epiteliais humanas procedentes de
carcinoma cervical
células HeLa

• George Gey - 1952

- Utilizou meios indefinidos e complexos
Plasma de aves Extrato de embrião bovino Cordão
umbilical humano
Dificuldade para analisar a composição específica
para cada tipo celular se desenvolver e funcionar
normalmente
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Fator de crescimento nervoso estimula o
crescimento dos axónios em cultura de tecidos
Stanley Cohen - 1954
Harry Eagle 1955
Investigou os requerimentos nutritivos das
células em cultivo
Sais Glicose AminoácidosVitaminas
Células cultivadas em condições experimentais
definidas
Soro de proteínas

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Meio Basal de Eagle (BME) ? aa essencias Meio
Mínimo Essencial de Eagle (MEM) ? aa Meio MEM
modificado por Dulbecco (DMEM) ? 4x aa
Soro fetal bovino
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Células morrem após um número finito de divisões
em cultura
Leonard Hayflick e Paul Moorhead - 1961
Fibroblastos jovens
Fibroblastos velhos
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• Ham -1965

1º meio livre de soro capaz de manter algumas
células de mamíferos em cultivo

• quimicamente definido

Sais Glicose Vitaminas Aminoácidos
Pequenas moléculas
Proteínas específicas
Sobreviver e proliferar
Possibilitou o estudo de moléculas sinalizadoras
extracelulares
Fatores de crescimento
Transferrina
Essenciais para sobrevivência, desenvolvimento e
proliferação de tipos de células específicos
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Harris e Watkins - 1965
1º heterocário de células de mamíferos pela fusão
Humano Camundongo
Mitose ? crs. no mesmo núcleo ? células híbridas
Linhagens com composição cromossômica
Localizar genes no genoma e banco de DNA de crs.
específicos


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• Augusti- Tocco e Sato - 1969

1ª linhagem celular estável a partir de uma
célula tumoral de nefroblastoma de camumdongo ?
eletricamente excitáveis
1975
1ª linhagem celular produtora de anticorpos
monoclonais hibridomas
Linfócitos B do baço com antígeno do anticorpo
desejado inoculado
Células de mieloma que se reproduzem em cultura
indefinitamente

Cesar Milstein
Células produzindo o anticorpo desejado
George Kohler
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• Hayashi e Sato 1976

Trabalhos demonstrando linhagens celulares
misturas de hormônios e fatores de crescimento
Células crescerem em meios livres de soro
1977
1º introduzir genes de cópias únicas de mamíferos
in vitro
Gene que codifica a enzima timidina quinase em
células com esse gene deficiente
Michael Wigler
Avanço na cultura celular pela possibilidade de
produzir proteínas terapêuticas em grande escala
Richard Axel
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• Martin Evans -1986

Isolou e cultivou células totipotentes de ratos
James Thomson e John Gearhart 1998
Isolaram e mantiveram vivas in vitro células
embrionárias humanas
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Bactéria
X
Células de tecido
Cultivadas em superfície sólida
Cultivadas em suspensão
Duplicação em 30 min.
Duplicação em 18 - 24 hrs
Células
Componentes específicos da Matriz Extracelular
Colágeno
Laminina
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Tipos de cultura celular

• Cultura primária preparada diretamente do
  tecido de um organismo, com ou sem fracionamento
  inicial das células
• Cultura secundária a partir de células
  retiradas da placa de cultura primária
  ?Subcultivos

Promove nova fonte de nutrientes e espaço para o
crescimento contínuo de linhagens celulares
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Linhagem de células

• Células morrem após um nº finito de divisões em
  cultura
• Mutação ? Células imortais proliferam
  indefinidamente

linhagem de células
Podem ser armazenadas em N líquido e continuarem
viáveis
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• Linhagem de células podem ser preparadas a partir
  de células de câncer

Proliferam-se em altas densidades
Crescem sem se fixarem a uma superfície

• Linhagem de células normais transformadas

Substâncias químicas
Vírus indutor
Linhagens celulares são importantes na pesquisa
celular ? alta quantidade de células de um
determinado tipo
Não são idênticas
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• Clonagem celular

• Uma célula isolada origina a cultura
• Células geneticamente idênticas

Importância linhagens de células mutantes com
defeito em um gene específico
Função da proteína em células normais
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Aplicações

• Reproduzir fenômenos que ocorrem in vivo mas que
  são inacessíveis

adicionar ou remover moléculas específicas

• Estudo da fisiologia e metabolismo de células
  específicas
• Estudar interações entre vários tipos de células
  culturas mistas
• Estudo de neoplasias
• Testar drogas ou compostos químicos
• Possibilidade de gerar tecidos artificiais
• Produção de proteínas terapêuticas

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Vantagens

• Reprodutibilidade dos resultados

• Linhagem de células clonais
• Controle das condições ambientais

• Possibilidade de selecionar uma população de
  células específicas
• Conhecimento do comportamento e função das
  células selecionadas

Desvantagens

• Perda das características cultivo longo
• Necessidade de marcadores
• Confiabilidade dos resultados in vivo ex
  drogas
• Contaminação

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Cuidados

• Biossegurança
• Sala separada especial
• Esterilizar todos os materiais e equipamentos com
  álcool 70
• Luz UV
• Usar luvas estéreis, máscara...
• Não reutilizar materiais
• Material biológico ? lixo separado

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Protocolo para cultivo celular

• Cultivo de celulas de câncer de mama

• Biopsia do tecido
• meio de congelamento ? meio de cultura DMSO
  antibiótico
• 2 horas em geladeira
• 30 min a 5 cm do N liquido (p congelar aos
  poucos)
• armazenar em N Liquido

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Protocolo para cultivo celular

• Cultivo de células de câncer de mama

• Biópsia do tecido
• Coletada e armazenada em meio de transporte

- 100 ml meio RPMI - 1 ml de antibiótico
3 ml -Tubo falcon

• Preparação inicial
• limpeza com álcool e UV 20 min
• Meio de cultura, PBS, tripsina banho maria a
  37ºC

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Preparo do meio de cultura

• 20 ml soro fetal bovino
• 1 ml antibiótico/antimicótico
• 1 ml L-glutamina
• 100 ml de meio de cultura RPMI 1640

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• Processamento do fragmento tumoral
• Lavar o tumor com PBS (4x 2 min)
• Tesoura ou bisturi
• 1 ml de meio RPMI 1640 no frasco T-25
• Estufa 37ºC 5 CO2

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• 1 ou 2 dias depois adicionar 1ml de meio
  lentamente para não soltar as células
• Trocar o meio de cultura a cada 2 dias
• Retirar o meio com a pipeta
• 4ml de meio frasco T-25
• 8 ml de meio frasco T-75
• O meio deve ser descartado com hipoclororito

• Subculturas
• Retirar o meio de cultura
• Lavar com PBS 1X
• Retirar o PBS
• Adicionar 2 ml de tripsina
• Aguardar 4 10 min o desprendimento das células
• Passar todo conteúdo do frasco para outro frasco
• Adicionar 2 ml de meio de cultura
• Colocar na estufa 37ºC 5 CO2

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Capela de fluxo para cultura celular
Placa six-wells
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Congelamento de células

• Tripsinizar
• Colocar em tubo falcon
• Centrifugar a 1600 rpm 5 min
• Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet
  em 900 ul de meio e 100 ul de DMSO
• Passar para criotubo
• Geladeira por 30 min
• Frezeer 80ºC 24 hrs
• Nitrogênio líquido

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Descongelamento das células

• Retirar o criotubo do N líquido
• Banho maria a 37ºC 90 seg.
• Transferir para tubo falcon 15ml contendo 10 ml
  de meio
• Centrifugar 5min
• Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de
  células em meio de cultura
• Transferir para frasco T-25
• Estufa

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Invertoscópio
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4x
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10x
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10
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40x
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4x e 10x
Fungo
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Obrigada