Diapositiva 1

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Università degli Studi di Torino Corso di Laurea
Specialistica Biotecnologie Mediche Immunologia
Molecolare
Emoglobinuria Parossistica Notturna
Genuardi Elisa
22 novembre 2007
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LEmoglobinuria Parossistica Notturna (PNH) è una
rara patologia acquisita caratterizzata da
unespansione clonale non maligna di una o più
cellule staminali ematopoietiche, causata da
mutazioni somatiche a livello del gene PIGA sul
cromosoma Xp22
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Un po di Storia
1866 Sir William Gull descrisse il caso di un
giovane paziente con ematinuria 1882 Strubin,
riconobbe Hb come pigmento delle urine nei casi
descritti 1928 Enneking conia il nome di
Emoglobinuria Parossistica Notturna 1930 Ham
osserva che i globuli rossi nella PNH sono
sensibili alla lisi mediata dal complemento 1956
deficit di AChE negli eritrociti di pz con PNH
1970-1990 identificazione delle proteine
transmenbrana mancanti nei globuli rossi si pz
con PNH con un ruolo nella lisi
complemento-mediata
1993 Kinoshita isola il gene PIG A come
responsabile delle caratteristiche molecolari
dellEMOGLOBINURIA PAROSSISTICA NOTTURNA
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PIG A e biosintesi delle GPI anchor proteins
PIG A
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http//www.ncbi.nlm.nih.gov
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le Conseguenze.
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CD 55 e CD 59
CD59
CD55
http//asheducationbook.hematologylibrary.org
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INIBIZIONE ATTIVITA FIBRINOLITICA e INDOTTA
ESPRESSIONE ATTIVITA PROTROMBINICA
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Caratteristiche Cliniche

• Emoglobinuria
• Trombosi
• Anemia
• Disfagia
• Dolori addominali
• Spasmi esofagei
• Impotenza maschile

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Diagnosi
TEST DI HAM? studia la sensibilità delle emazie
al complemento in mezzo acido a ph 6.5 e a
37C TEST AL SACCAROSIO? studia lanomala
sensibilità al complemento delle emazie in un
mezzo a debole forza ionica
LIMITI Non sensibile No quantificativo Falsi
negativi
Adattata da Pasquinelli F.Diagnostiche e
Tecniche di Laboratorio
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CITOFLUORIMETRIA

• Permette la quantificazione
• Tecnica sensibile (minimo 0,003 cells GPI -AP-)
• Utilizzo di MoAb che riconoscono GPI anchor
  proteins (anti-CD55 e anti CD 59) e Moab verso
  marker specifici delle linee cellulari

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FLAER (Fluorescently Labelled Inactive variant of
the Protein Aerolysin)
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• Alta affinità e specificità per lancora delle
  GPI-APs

• Identifica, in base alla cloni PNH, pazienti a
  rischio di trombosi
• La di granulociti è indice di dolori
  addominali, grado di emolisi, spasmi orofagei e
  disfunzioni erettili.

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MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO
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MOISACISMO CELLULARE SOMATICO
Osservato con test di sensibilità alla lisi
complemento-mediata e confermato con esperimenti
di citofluorimetria e FLAER Pazienti con PNH
possono presentare 3 popolazioni di GR PNH I ?
normali, GPI-APs presenti PNH II ? deficit
parziale di GPI-APs PNH III ? deficit totale La
gravità della patologia è molto influenzata dalla
percentuale di cellule appartenenti alle 3
popolazioni!!
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???MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO????
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Gene PIG A(6 esoni) Esone 1 molto corto, non è
tradotto Esone 2 codifica per gran parte del
trascritto Proteina di 54 kD, 484 aa con una
sequenza idrofobica di 27 aa nei pressi del C-
terminale
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Xp22
Modelli in vivo KO Pig A ? letale a livello
embrionale KO condizionali? emolisi
intravascolare (conferma aspetti clinici)
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Donne e uomini stessa frequenza di PNH
Mutazioni somatiche su PIG A
PNH
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• INSERZIONI E DELEZIONI
• Mutazioni missense (cambio aa)
• Mutazioni nonsense (stop codon prematuro)
• Mutazioni su siti di splicing (lunghezza mRNA e
  stabilità)

Le Mutazioni
1995? Bessler et al analizzano il cDNA di PIG A
in quattro linee cellulari GPI-AP-
DELEZIONE regione promoter (CAAT motifs), esone 1
e parte dellintrone 1 determina una diminuita ma
non assente espressione delle GPI-APs
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La perdita del trascritto funzionante è dovuta a
exon skipping dellesone 2
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2005 Hu et al. osservano mutazioni a livello di
PIG A anche in cellule di sani
Policlonali
Avvengono su cellule che non si autorinnovano
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Molti studi clinici individuano in pazienti con
patologie ematologiche una percentuale di cellule
GPI-APs -
?
ANEMIA APLASTICA
PNH
MIELODISPLASIE
P.S anche i sani hanno mutazioni somatiche in
PIG A
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Riconosciuto come non self? REAZIONE
AUTOIMMUNITARIA
HSC
Antigene self ??? GPI-AP???
ESCAPE ALLA REAZIONE IMMUNITARIA Ma Deficit di
GPI-APs? EMOLISI e PNH!!!!
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DUE REQUISITI

• Presenza di mutazioni a livello di PIG A

• Presenza di un microambiente idoneo, da cui le
  cellule GPI-APs possono trarre un vantaggio
  selettivo alla crescita ( escape alla reazione
  autoimmunitaria)

• Nei pazienti con PNH le mutazioni a carico del
  gene PIG A sono CLONALI ( colpiscono la stessa
  regione del gene)

Il clone che trae maggior vantaggio alla crescita
dal microambiente autoimmune, prolifera senza
limiti per ripristinare una normale emopoiesi
Telomere Restriction Fragments di pz con PNH è
molto più corto rispetto ai sani? evidenza di una
spiccata proliferazione
A livello periferico si riflette la mancanza
delle GPI-APs
IL CLONE PNH NON È UNO STATO PRELEUCEMICO!!!
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La PNH è una rara patologia acquisita
caratterizzata da unespansione clonale non
maligna di una o più cellule staminali
ematopoietiche
Classical PNH
PNH associata a bone marrow failure
Subclinical PNH (nessun segno clinico di emolisi)
un po di dati

• Sono affetti da PNH 8000-10000 persone nel Nord
  America e Europa Occidentale
• Età di insorgenza 30-40 anni (10 dei casi
  insorge a 21 anni o meno)
• 50 dei pz muore per trombosi, infezioni (America
  Europa occidentale) o neoplasie ematologiche
  (Asia e paesi Orientali)
• Sopravvivenza stimata 10 anni

• Terapia mirata ad ogni singola caratteristica
  clinica

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TERAPIA
CORTICOSTEROIDI? emolisi cronica ANDROGENI in
possibile combinazione con STEROIDI?inibizione
del complemento SOMMINISTRAZIONE FERRO e
FOLATI/TRASFUSIONI ? anemia (attenzione alle
patologie da sovraccarico di ferro e
incompatibilità sistema ABO) WARFARINA? trombosi
Ma il futuro è.
ECULIZUMAB (against complement C5)
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