NK bunky Interferony

1
NK bunkyInterferony
2
NK bunky

• Nemají antigenne specifické receptory
• Rozeznávají bb., které mají abnormálne málo
  MHCgpI (nekteré nádorové a virem infikované bb.)
• Jsou schopny zabíjet rychle bez predchozí
  stimulace, proliferace a diferenciace
• Aktivátory NK bb. IFNa, IFNb
• Povrchové znaky CD16, CD56

3

• Stimulacní receptory NK bb. - nekteré povrchové
  lektiny,
  Fc receptor CD16
• ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity)
  cytotoxická reakce závislá na protilátkách NK
  b. prostrednictvím Fc receptoru CD16 rozpozná
  bunku opsonizovanou protilátkami trídy IgG, to
  vede k aktivaci cytotoxických mechanismu
  (degranulaci NK bb.)
• Inhibicní receptory NK bb. signály poskytnuté
  prostrednictvím techto receptoru inhibují
  cytotoxické mechanismy rozpoznávají MHC gpI.
• Imunoglobulinová skupina tzv. KIR (killer
  inhibitor receptors)
• C-lektinová skupina napr. CD94/NKG2

4
Aktivace NK bunek
5
Cytotoxické mechanismy NK bunek

• Výsledná reakce NK b. po setkání s jinou bunkou
  závisí na tom, zda preváží stimulacní nebo
  inhibicní signály
• Cytotoxická granula obsahující perforin a
  granzymy (perforin vytvárí póry v cytoplazmatické
  membráne napadené bunky,v nekterých prípadech
  muže dojít k osmotické lýze napadené bunky,
  vytvorenými póry se do bunky dostávají granzymy,
  které aktivují caspázy, což vede k apoptóze
  napadené bunky
• Fas-ligand (FasL) který se váže na apoptotický
  receptor Fas (CD95) prítomný na povrchu mnoha
  ruzných bb.
• TNFa

6
(No Transcript)
7
ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity)
8
Interferony

• Patrí k humorální složce nespecifických
  mechanismu
• IFNa - produkován virem napadenými lymfocyty,
  monocyty a makrofágy
• IFNb - produkován virem infikovanými fibroblasty
  a epiteliemi
• IFNa a IFNb váží se na receptory na povrchu
  infikovaných a zdravých bb. a navozují v nich
  antivirový stav (syntéza enzymu, které blokují
  replikaci viru v bunce)
• IFNg produkován TH1 bunkami, má regulacní
  funkci, aktivuje makrofágy a stimuluje expresi
  MHCgp

9
Bazofily a mastocyty a jejich význam v imunitních
reakcích
10
Mastocyty ( žírné bunky)

• Sliznicní mastocyty ve sliznicích dýchacího a
  gasrtointestinálního traktu, produkují histamin,
  serotonin, heparin, tryptázu,leukotrien C4,
  úcastní se pri parazitózách a pri alergiích
• Pojivové mastocyty v pojivové tkáni, produkují
  tryptázu, chymázu, PGD2, jsou zmnoženy pri
  fibróze, pri parazitózách a alergiích se
  neúcastní

11
Funkce mastocytu

• obrana proti parazitárním infekcím
• za patologických okolností jsou zodpovedné za
  casný typ precitlivelosti (imunopatologická
  reakce typu I)
• regulace imunitní odpovedi
• uplatnují se pri zánetu, pri angiogenezi, pri
  remodelaci tkání
• podílejí se na udržování fyziologických funkcí
  sliznic
• prispívají k normálnímu metabolismu pojivových
  tkání
• komunikace mezi imunitním a nervovým systémem

12
Aktivace mastocytu

• Žírné bunky mohou být stimulovány k degranulaci
  prostrednictvím - prímého poškození (opiáty,
  alkohol a nekterá
  antibiotika)
• - propojením Fc
  receptoru pro IgE
• - anafylatoxiny (C3a,
  C5a)

13
Aktivace mastocytu prostrednictvím IgE

• Po navázání multivalentního antigenu (
  mnohobunecného parazita) pomocí IgE na
  vysokoafinní Fc receptor pro IgE (Fc?RI) dojde k
  agregaci nekolika molekul Fc?RI
• Iniciace degranulace mastocytu ( fúze
  cytoplazmatických granulí s povrchovou membránou
  a uvolnení jejich obsahu)
• Aktivace metabolismu kyseliny arachidonové
  (leukotrien C4, prostaglandin PGD2)
• Zahájení produkce cytokinu (TNF, TGF?, IL-4,5,6)

14
Aktivace mastocytu prostrednictvím IgE
15
Sekrecní produkty mastocytu

• cytoplazmatická granula hydrolytické enzymy,
  proteoglykany (heparin, chondroitinsulfát),
  biogenní aminy (histamin,serotonin)
• Histamin zpusobuje vasodilataci, zvýšení
  vaskulární permeability, erytém, edém, svedení,
  kontrakci hladké svaloviny bronchu, zvýšení
  peristaltiky strev, zvýšení sekrece hlenu
  sliznicními žlázkami v respiracním traktu a GITu
  (napomáhá eliminaci parazita)
• Metabolity kys. arachidonové (leukotrien C4,
  prostaglandin PGD2)
• Cytokiny (TNF, TGF?, IL-4,5,6)

16
Úloha mastocytu pri rozvoji alergické reakce
17
Bazofily

• diferencují se z myeloidního prekurzoru
• bývají považovány za cirkulující formu mastocytu
• receptorovou výbavou, obsahem granul, mechanismy
  stimulace a funkcemi jsou velmi podobné
  mastocytum
• jsou zodpovedné za vznik anafylaktického šoku

18
HLA systém(MHC glykoproteiny)
19
MHC glykoproteiny I. trídy (major
histocompatibility complex)

• Funkcí MHC gpI je prezentace peptidových
  fragmentu, které jsou produkovány bunkou (vcetne
  virových, pokud jsou prítomny), na bunecném
  povrchu tak, aby byly rozpoznávány T lymfocyty
  (cytotoxickými CD8)
• Prítomny na všech jaderných bunkách organismu
• 3 izotypy klasických lidských MHC gp. ( HLA - A,
  -B, -C )
• 3 izotypy neklasických MHC gp. ( HLA E, -F, -G
  molekuly CD1)

20
Prezentace peptidového fragmentu pomocí MHC gp
I. trídy cytotoxickému T lymfocytu
21
Struktura MHC gp I

• MHC gp. I. trídy se skládají z transmembránového
  retezce a a nekovalentne asociovaného
  b2mikroglobulinu
• Retezec a má 3 domény, 2 N-terminální (a1, a2
  vazebné místo pro peptidy) a 1 C-terminální
  doménu (a3 zakotvena v cytoplazmatické
  membráne)
• Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní
  konformaci MHC gp a tím zajištuje jeho
  dlouhodobou prezentaci na bunecném povrchu

22
Vazba peptidu na MHC gp I

• MHC gp I váží peptidy o délce 8 až 10 AK
• Urcitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející
  spolecné strukturní rysy - vazebný motiv
  (rozhodující jsou AK poblíž koncu peptidu)
• K vazbe endogenních peptidu dochází v
  endoplazmatickém retikulu behem biosyntézy MHC
  gp.
• Po vytvorení retezce a a b2mikrotubulinu dochází
  v ER k poskládání do správné konformace a k
  vzájemné asociaci a k asociaci vhodného peptidu,
  tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu
  a pak je prezentován na bunecném povrchu
• Navázané peptidy pocházejí z proteinu
  degradovaných proteazómem, který štepí
  cytoplasmatické proteiny urcené k likvidaci
  (oznacené ubiquitinem), peptidové fragmenty jsou
  transportovány do ER pomocí specifických
  membránových pump

23
Vazba peptidu na MHC gp I
24
Vazba peptidu na MHC gp I
25
Neklasické MHC gp. I

• HLA E, -F, -G molekuly CD1
• Strukturne podobné klasickým MHC gp
• Jsou méne polymorfní
• Vyskytují se jen na nekterých bunkách
• Specializují se na vazbu zvláštních ligandu

26

• HLA-E a HLA-G - vyskytují se na bunkách
  trofoblastu
• Komplexy HLA-E a HLA-G s peptidy jsou
  rozpoznávány inhibicními receptory NK bunek a
  prispívají k toleranci plodu v deloze

27
MHC glykoproteiny II. trídy

• Funkcí MHC gp II je prezentace peptidových
  fragmentu z proteinu pohlcených bunkou tak, aby
  byly rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými CD4)
• Vyskytují se na APC ( dendritické bunky,
  monocyty, makrofágy, B lymfocyty)
• 3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )

28
Struktura MHC gp II

• MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentne
  asociovaných transmembránových podjednotek a a
  b
• Vazebné místo pro peptid je tvoreno
  N-terminálními doménami a1 a b1
• Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci
  MHC gp a tím zajištuje jeho dlouhodobou
  prezentaci na bunecném povrchu

29
Vazba peptidu na MHC gp II

• MHC gp II váží peptidy o délce 15 až 35 AK (ale i
  delší - vazebné místo pro peptid je na obou
  koncích otevrené)
• Urcitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející
  spolecné strukturní rysy - vazebný motiv
• Po vytvorení retezce a a b v ER dochází k
  poskládání do správné konformace a k vzájemné
  asociaci a k pripojení dalšího transmembránového
  retezce, tzv. invariantního retezce, který
  blokuje vazebné místo pro peptid, tento komplex
  je dále zpracován v Golgiho aparátu sekrecní
  vácky oddelené od GA fúzují s endozómy, poté se
  rozštepí invariantní retezce a do vazebného místa
  MHC gp se naváží peptidové fragmenty
  endocytovaných proteinu a poté je komplex
  prezentován na bunecném povrchu

30
Vazba peptidu na MHC gp II
31
Antigenní prezentace
32
(No Transcript)
33

• Prezentace antigenu T lymfocytum
• Signál TCR MHC gp I(II)Ag peptid (APC)
• Signál kostimulacní CD 28 (Tlymfocyt) CD 80, CD
  86 (APC)

34
Polymorfismus MHC glykoproteinu

• HLA komplex se nachází na chromozómu 6
• U MHC gp je vysoký polymorfismus, tzn. existují
  až stovky ruzných alelických forem jednotlivých
  izotypu (krome neklasických MHC gp. I a krome DR
  retezce a)
• Kodominantní dedicnost alelických forem(jedinec
  má na povrchu bunek 3 izotypy HLA molekul
  (HLA-A, -B, -C) vetšinou ve 2 ruzných alelických
  formách)
• Polymorfismus má ochranný význam na úrovni
  jedince i na úrovni populace
• Polymorfismus MHC gp zpusobuje komplikace pri
  transplantacích

35
HLA typizace urcení HLA antigenu na povrchu
lymfocytuProvádí se pri predtransplantacním
vyšetrení a pri urcení paternity

• 1) Sérologická typizace
• mikrolymfocytotoxický test
• allospecifická séra ( získaná od vícenásobných
  rodicek do 6 týdnu po porodu, získaná vakcinací
  dobrovolníku, nebo komercne pripravené sety
  typizacních sér (monoklonální protilátky))
• princip - inkubace lymfocytu s typizacními séry
  za prítomnosti králicího
  komplementu, poté je pridáno vitální barvivo,
  které obarví mrtvé bunky
  - bunky nesoucí urcité HLA jsou usmrceny
  cytotoxickými Ab proti tomuto
  Ag, procento mrtvých bunek je mírou toxicity
  séra (síly a titru antileukocytárních
  protilátek)
• za pozitivní reakci se považuje více než 10
  mrtvých bb.
• (sérologickou typizaci lze provádet i pomocí
  prutokové cytometrie)

36

• 2) Molekulárne genetické metody
• Pro typizaci se používají hypervariabilní úseky
  ve II. exonu genu kódujících HLA II. trídy, pro
  urcení HLA I. trídy se používá polymorfismus v
  II. a III. exonu kódujících genu
• 2a) PCR-SSP
• polymerázová retezová reakce se sekvencními
  specifickými primery
• extrahovaná DNA slouží jako substrát v sade PCR
  reakcí
• každá PCR reakce obsahuje primerový pár
  specifický pro urcitou alelu (resp. skupinu alel)
• pozitivní a negativní reakce se hodnotí
  elektroforézou
• každá kombinace alel má svuj specifický
  elektroforetický obraz

37

• 2b) PCR-SSO
• PCR reakce se sekvencne specifickými
  oligonukleotidy
• namnoží se hypervariabilní úseky genu kódujících
  HLA
• hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivne
  znacenými DNA sondami specifickými pro jednotlivé
  alely
• 2c) PCR- SBT
• sequencing based typing sekvenování
• nejpresnejší metodika HLA typizace
• získáme presnou sekvenci nukleotidu, kterou
  porovnáme s databází známých sekvencí HLA alel

38
Imunoglobuliny
39
Struktura imunoglobulinu

• 2 težké (H) retezce kovalentne spojeny
  cystinovými mustky, ke každému H retezci je
  cystinovým mustkem pripojen lehký (L) retezec
• H retezec se skládá ze 4 až 5 domén (1
  variabilní, 3-4 konstantní)
• L retezec se skládá ze 2 imunoglobulínových domén
  (1 variabilní, 1 konstantní)
• Typy L retezcu - k, l
• Typy H retezcu m, d, g (g1-4), a (a1,a2), e

40
(No Transcript)
41

• Variabilní domény L a H retezce tvorí vazebné
  místo pro Ag
• Pantová oblast místo, kde jsou težké retezce
  spojeny cystinovými mustky
• Fc cásti imunoglobulínu jsou silne glykosilovány,
  váží se na Fc receptory
• J retezec
• Sekrecní komponenta

42
Funkce imunoglobulinu

• Neutralizace Ag
• Aglutinace Ag
• Aktivace komplementu
• Opsonizace
• Aktivace mastocytu prostrednictvím IgE
• ADCC

43
Funkce imunoglobulinu
44
Trídy imunoglobulínu a jejich funkce

• Rozlišujeme podle konstantní cásti H retezce
• IgM, IgD, IgG ( IgG1 IgG4), IgA (IgA1, IgA2),
  IgE
• IgM - jako monomer tvorí BCR -
  sekretovaný ve forme pentameru (10 vazebných
  míst) - první izotyp, který se tvorí po
  setkání s Ag - neutralizace Ag, aktivuje
  komplement, neváže se na Fc receptory
  fagocytu - (koncentrace 0,9 2,5 g/l
  biol. polocas 6 dnu)
• IgD - jako monomer tvorí BCR - v séru se
  nachází ve velmi malé koncentraci
• - (koncentrace 0,1 g/l biol. polocas
  3 dny)

45

• IgG - jednotlivé izotypy IgG1-IgG4 se liší
  schopností aktivovat komplement a vázat
  se na Fc receptory fagocytu
  (opsonizace)
• - funkce neutralizace, opsonizace,
  aktivace komplementu
• - prestupuje placentou
• - tvoren pri sekundární imunitní
  odpovedi - (koncentrace 8 18 g/l biol.
  polocas 21 dnu)

46

• IgA - sliznicní IgA - ochrana sliznic,
  neutralizace,
  opsonizace, neaktivuje komplement
  - dimér se sekrecní komponentou
  - sliny, slzy,
  materské mléko - sérový IgA monomer,
  dimer ci trimer - (koncentrace 0,9 3,5
  g/l biol. polocas 6 dnu)
• IgE - uplatnuje se pri obrane proti mnohobunecným
  parazitum - je hlavní prícinou
  alergických reakcí
• - (koncentrace 3x10-4 g/l biol.
  polocas 2 dny)

47
(No Transcript)
48
Genetický základ tvorby imunoglobulinu
49

• Genové segmenty pro H retezce - chromozóm 14
• V (variabilita) - nekolik set
• D (diversita) - asi 50
• J (joining) 9
• C konstantní cásti H retezce
• Genové segmenty pro L retezce - k chromozóm 2
• 
  - l chromozóm 22
• V (variabilita)
• J (joining)
• C konstantní cásti L retezce
• Na koncích V, D, J úseku jsou signální sekvence,
  které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázami,
  které provádejí preskupování techto genu
• Po stranách C segmentu jsou tzv. switch sekvence
  (presmykové), které jsou rozpoznávány enzymy
  rekombinázami, které provádejí izotypový presmyk

50
Preskupování genu kódujících H retezce

• D-J preskupení - vyštepení úseku IgH mezi
  nekterým D a J segmentem (probíhá na obou
  chromozómech)
• V-D preskupení vyštepení úseku mezi nekterým V
  segmentem a DJ pokud je preskupení na nekterém
  z chromozómu úspešné, zastaví se preskupování na
  druhém chromozómu tzv. alelická exkluze ( to
  platí i pro L retezce) Prepis preskupeného IgH
  genu do mRNA, sestrih primárního transkriptu.
  Jako první se tvorí H retezce m.
• Není-li preskupování úspešné, B lymfocyt
  hyne.

51
Preskupování genu kódujících L retezce

• Nejprve se preskupují geny kódující L retezec k,
  dochází k vyštepování úseku mezi nekterým V a J
  segmentem (soubežne na obou chromozómech), pokud
  je preskupení na nekterém z chromozómu úspešné,
  zastaví se preskupování na druhém chromozómu
  tzv. alelická exkluze.
• Jestliže není preskupování k genu úspešné,
  zahájí se preskupování genu l.
• Ne všechny H a L retezce mohou spolu tvorit
  stabilní dimery.
• Není-li preskupování úspešné, B lymfocyt
  hyne.

52
Izotypový presmyk (class switch)

• Dochází k nemu behem terminální diferenciace B
  lymfocytu po aktivaci Ag na povrchu FDC (nezbytný
  kostimulacní signál pres CD40)
• Enzymy rekombinázy rozpoznávají switch sekvence
  lokalizované po stranách C segmentu (tato
  sekvence není mezi Cm a Cd segmenty B bunka
  muže pred izotypovým presmykem produkovat IgM i
  IgD zároven)a vyštepují úseky genu
• Po eliminaci cásti C oblasti je do mRNA prepsán
  ten segment, který je nejblíže VDJ segmentu a po
  sestrihu a translaci vzniká príslušný izotyp H
  retezce

53
(No Transcript)
54
Izotypový presmyk (class switch) - pokracování

• Cytokiny regulují k jakému izotypovému presmyku
  dojde
• IL-4 stimuluje presmyk na IgE a IgG1, IgG4
• TGFb stimuluje presmyk na IgG2 a IgA

55
Antiidiotypové protilátky

• IDIOTOP každá determinanta variabilní cásti
• protilátky, muže být soucástí
  paratopu, ci muže ležet mimo
  paratop
• IDIOTYP soubor idiotopu souhrn identických
  vazebných struktur pro Ag
  na protilátkách stejné specifity
• Idiotypické struktury protilátek 1. generace
  jsou rozpoznávány nekterými B lymfocyty jako
  antigeny a mohou se proti nim tvorit tzv.
  antiidiotypové protilátky (protilátky 2.
  generace nekterá vazebná místa mohou
  pripomínat Ag, který vyvolal tvorbu
  protilátek 1. generace)
• Proti protilátkám 2. generace se tvorí
  protilátky 3. generace (anti-antiidiotypové
  protilátky)
• Tato idiotypová sít muže hrát roli v regulaci
  protilátkové odpovedi

56
B lymfocyty
57
B lymfocyty

• B-lymfocyty (B bunky) jsou bunky zodpovedné
  predevším za specifickou, protilátkami
  zprostredkovanou imunitní odpoved. Mají rovnež
  velký význam pro imunitní pamet (využívá se pri
  ockování).
• B-lymfocyty rozpoznávají nativní antigen pomocí
  BCR (B cell receptor)
• Príslušný B-lymfocyt, na jehož receptorech došlo
  k vazbe antigenu, je stimulován k pomnožení a
  diferenciaci na efektorové neboli plazmatické
  bb., které produkují velké množství protilátek
  stejné specifity, jako je BCR (jde vlastne o
  tentýž protein v rozpustné forme), vážou se tedy
  na stejný antigen. Z cásti stimulovaných
  B-lymfocytu se diferencují pametové bunky.

58
Povrchové znaky B lymfocytu

• CD 10 - nezralý B lymfocyt
• CD 19 - charakteristický povrchový znak B
  lymfocytu
• CD 20 - na povrchu Ig-pozitivních B lymfocytu
• IgM, IgD - BCR
• MHC gp II.trídy - Ag prezentující molekuly
• CD 40 kostimulacní receptor

59
Vývoj B lymfocytu

• Vývoj B lymfocytu probíhá v kostní dreni a
  dokoncuje se posetkání s Ag v sekundárních
  lymfatických orgánech.
• Pluripotentní hematopoetická kmenová bunka
• Progenitor B lymfocytu ? zahájení rekombinacních
  procesu, které
  vedou ke vzniku velkého množství klonu
  B
  lymfocytu s individuálne specifickými BCR
• Pre B lymfocyt ? exprese pre-B receptoru (tvoren
  H(m) retezcem a
  náhradním L retezcem)
• Nezralý B lymfocyt ? exprese povrchového IgM
  (BCR) v této fázi
  vývoje dochází k eliminaci autoreaktivních
  klonu
• Zralý B lymfocyt ? exprese povrchového IgM a IgD
  (BCR)

60
BCR

• BCR se skládá z povrchového imunoglobulinu (IgM,
  IgD H retezce jsou transmembránové rozeznává
  Ag) a asociovaných signalizacních molekul (Iga a
  Igb), které jsou asociovány s cytoplazmatickými
  protein tyrosin-kinázami (PTK) skupiny Src
• Po soucasném navázání Ag na 2 ci více BCR dojde k
  priblížení PTK, vzájemné fosforylaci a
  fosforylaci dalších cytoplazmatických proteinu,
  což vede ke zmenám transkripce genu, proliferaci,
  diferenciaci a sekreci protilátek
• Signály spuštené vazbou Ag na BCR mohou být
  zesíleny spoluprací s CR2, který váže C3dg
  (opsonin)

61
Eliminace autoreaktivních klonu B lymfocytu

• Pri náhodném preskupováním genu, spojovacích
  nepresnostech, párování H-L a somatických mutací
  mohou vzniknout i klony B lymfocytu nesoucí
  autoreaktivní receptory a produkující
  autoreaktivní protilátky.
• Vetšina autoreaktivních B lymfocytu je
  eliminována na úrovni nezralých B lymfocytu (v
  kostní dreni), jestliže svým BCR váží autoantigen
  s dostatecnou afinitou, obdrží signál vedoucí k
  apoptotické smrti.
• Pokud touto eliminací projdou nekteré
  autoreaktivní klony, jejich autoreaktivita se
  vetšinou neprojeví, protože k jejich aktivaci
  chybí príslušné TH lymfocyty, mnohé autoantigeny
  jsou kryptické, ci se vyskytují v malé
  koncentraci a jsou imunitním systémem ignorovány.

62
Setkání B lymfocytu s Ag v sekundárních
lymfatických orgánech
63
(No Transcript)
64
Ontogeneze tvorby protilátek

• Syntéza specifických protilátek zacíná kolem
  20.-24.týdne gestace, celková koncentrace IgA a
  IgM zustává až do porodu nemeritelná, IgG se
  zacínají tvorit až po porodu
• B lymfocyty na imunizaci reagují prevážne tvorbou
  IgM, presmyk na jiné izotypy je pomalejší
• Pozvolný nárust tvorby vlastních IgG za poklesu
  materských IgG (kolem 3.-6.mes.)

65
Ontogeneze tvorby protilátek

• Koncentrace IgM dosahuje hodnot srovnatelných s
  dospelými v 1.-3.roce života, IgGA mezi
  10.-15.r.
• Protilátková reakce na polysacharidové antigeny
  se objevuje až kolem 2.roku života
• Ve stárí je slabší protilátková odpoved na nové
  podnety a vyšší produkce autoprotilátek