Heteroduplex Heteroduplex mobility assay

1
HeteroduplexHeteroduplex mobility assay

• Biotechnologia III rok
• Sylwia Borkowska
• Malgorzata Gawlik
• Piotr Gawronski

2
Definicja

• Heteroduplex jest dwuniciowa molekula kwasu
  nukleinowego powstajaca podczas rekombinacji
  homologicznej z pojedynczych komplementarnych
  nici, pochodzacych z róznych zródel, np. z dwóch
  homologicznych chromosomów, czy nawet z dwóch
  róznych organizmów.
• Jednym takim przykladem jest heteroduplexowe DNA
  tworzone w czasie hybrydyzacji materialów
  genetycznych organizmów w celu ustalenia ich
  pokrewienstwa czy pochodzenia ( badania
  filogenetyczne).

3
Heteroduplexy powstajace in vivo w czasie
rekombinacji(w kompleksie synaptonemalnym
podczas koniugacji poprzedzajacej mejotyczny
crossing-over )
4
Heteroduplexy powstajace in vivo w czasie
rekombinacji

• Heteroduplexy powstajace in vivo w czasie
  rekombinacji umozliwiaja wymiane genów, a przez
  to takze naprawe uszkodzonych jednostek .

5
Zastosowania

• badania filogenetyczne
• analizy epidemiologiczne, np odnosnie
  Cryptosporidium wyizolowanych od ludzi i zwierzat
• badania screeningowe dotyczace wielu groznych
  wirusów HIV-1, WZW typu C, enterowirusów, w celu
  identyfikacji ich podtypów
• wykrywanie mutacji glównie punktowych i chorób
  genetycznych z nimi zwiazanych (mozna analizowac
  tylko krótkie odcinki kwasów nukleinowych, bo
  przewaznie na wstepie stosuje sie PCR, nie
  wykryjemy ta metoda mutacji chromosomowych i
  genomowych).

6
Podstawowe zalozenie

• Nici DNA tworzace Heteroduplexy róznia sie od
  siebie pewnymi sekwencjami i nie tworza tak
  stabilnych ukladów jak homoduplexy, czyli
  molekuly dwuniciowego DNA komplementarne do
  siebie.

7
Chcac wykryc w mieszaninie, po reakcji PCR,
Heteroduplexy (odróznic je od homoduplexów)
mozemy posluzyc sie sie metodami

• DGGE- (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)-
  elektroforeza w zelu z gradientem denaturujacym,
  która jest najdokladniejsza- ma 95 skutecznosc,
  ale i najdrozsza
• mismatch cleavage (rozlupywanie sie niedopasowan)
• DHPLC (Denaturing High Performance Liquid
  Chromatography)- Szybka chromatografia w
  roztworze denaturujacym

8
Opis DHPLC przy wykrywaniu mutacjiSzybka
chromatografia w roztworze denaturujacym
9
DHPLC

• mieszanina po reakcji PCR zawierajaca DNA
  wzorca-niezmutowane i DNA organizmu badanego-
  potencjalnie obarczone mutacja)
• Denaturacja (podgrzanie)
• Renaturacja (ochlodzenie)
• tworza sie homo- i heteroduplexy

10
DHPLC

• Rozdzial Hetero- od Homoduplexów jest osiagany
  poprzez dzialanie czesciowo denaturujacych
  czynników (temp. 57 C)
• Rejestrowane sa mikronapiecia towarzyszace
  przechodzeniu przez urzadzenie czasteczek DNA

11
DHPLC

• DNA jednoniciowe bedzie pochodzilo z
  heteroduplexów i jezeli zostanie wykryte przez
  detektor w odpowiednio wysokim stezeniu, bedzie
  to swiadczylo o mutacji w obrebie DNA badanego
• Jesli DNA organizmu badanego bedzie homozygota
  pod wzledem mutacji, to otrzymamy najwiekszy
  udzial Heteroduplexów w mieszaninie po PCR, a
  stezenie nici pojedynczych wykrytych podczas
  DHPLC bedzie wysokie,
• W przypadku heterozygotycznosci pod wzgledem
  mutacji DNA badanego otrzymamy mniejsze stezenie
  pojedynczych nici i dlatego dobrze jest wtedy
  powtórzyc DHPLC bez obecnosci wzorca-nie jest ona
  wymagana, bo DNA badane jest Heteroduplexem
• brak mutacji-brak heteroduplexów.

12
Wynik DHPLC

• DHPLC detection of mutation in the Fanconi anemia
  gene, exon-4 in Ashkenazi population.

13
Zródla informacji

• NCBI
• Wikipedia