UNIVERSIDAD AUT

1
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIAINSTITUTO
DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS VETERINARIASLABORA
TORIO DE SALUD PÚBLICA VETERINARIAII Congreso
Internacional de Leptospirosis,Sífilis y
Borreliosis"Espiroquetas Habana 2012"23 - 25 de
abril de 2012La Habana, CubaBorreliosis
(Borrelia burgdorferi) y factores de riesgo en
perros de una ciudad que sólo ha reportado
garrapatas Rhipicephalus sanguineus en caninos,
Mexicali, Baja California, México
Luis Tinoco Gracia
2
SAPUVETNETRed auspiciada por el Grupo Alfa de la
Unión Europea
Integrada por 16 países de América Latina y Europa
3
Mexicali, Baja California, México
Mexicali
4

• INTRODUCCIÓN
• BORRELIOSIS (ENFERMEDAD DE LYME)
• Enfermedad inflamatoria multisistémica
• Transmitida por garrapatas
• Zoonótica
• Distribución mundial
• ETIOLOGÍA Complejo Borrelia burgdorferi sensu
  lato.
• Norteamérica B. burgdorferi sensu stricto
  (Johnson, 1984).
• Europa B. afzelli y B. garinii
  (Berglund, 1995 Derdáková, 2003).
• Asia B. japonica (Kawabata, 1993).

5
BANCO DE GENES National Center for Biotechnology
Information (NCBI)
6
Ciclo biológico de I. scapularis relacionado con
B. burgdorferi
Transmisión de borrelias al huésped por garrapata
adulta
Huevos
Larvas
Transmisión de borrelias al huésped por ninfas
Reservorio
Otros vectores I. pacificus, A. americanum, D.
variabilis
7
BORRELIOSIS Enfermedad inflamatoria
multisistémica
Depresión, emaciación
Claudicación
Garrapatas
8

• ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN PERROS
• Monterrey, Nuevo León
• 16 (136/850) a B. burgdorferi por IFA
• (Salinas-Meléndez et al., 1999)
• Mexicali, B. C.
• 6.6 (2/30) a B. burgdorferi por ELISA
• (Romano et al., 1998)
• 8.2 (95 I.C. 1.5-13.3) a B. burgdorferi por
  ELISA
• (Tinoco et al., 2007)
• 59.6 (56/94) a garrapatas (100 Rhipicephalus
  sanguineus)
• (Tinoco et al., 2008)

9

• ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN HUMANOS
• Estados Unidos
• Actualmente 200,000 (CDC)
• República Mexicana
• Por ELISA y Western blot
• Distrito Federal 3.4
• Noreste de la Rep. Mexicana 6.2
  (Gordillo et al., 2003)

10
OBJETIVOS

1. Estimar la prevalencia de B. burgdorferi por
   ELISA y PCR en perros atendidos en clínicas
   veterinarias y en perros capturados por los
   centros de control animal y demostrar evidencia
   molecular en garrapatas por PCR, en Mexicali,
   Baja California, México.
2. Evaluar factores de riesgo asociados a B.
   burgdorferi en perros de la zona urbana de
   Mexicali, Baja California.
3. Demostrar la transmisión experimental de B.
   burgdorferi a través de la garrapata adulta R.
   sanguineus en perros.

11
MATERIAL Y MÉTODOS

• FASES DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
• Monitoreo de B. burgdorferi.
• Aislamiento de B. burgdorferi.
• Estudio experimental de la transmisión de B.
  burgdorferi por R. sanguineus.

12
1. MONITOREO

• MARCO MUESTRAL DEL AREA DE ESTUDIO
• Establecimientos
• 39 clínicas veterinarias de la ciudad de Mexicali
• 2 centros de control animal de Mexicali
• Sujetos (768)
• i) 384 Perros atendidos en clínicas
  veterinarias
• ii) 384 Perros capturados por los centros de
  control animal
• iii) Garrapatas recolectadas de los animales
  muestreados

13

• Muestreo sanguíneo y de garrapatas
• Perros atendidos en clínicas veterinarias
• Perros capturados por los centros de control
  animal
• Garrapatas conservadas en tubos con etanol al 70
  o congeladas a -20C.

14
DIAGNÓSTICO

• PERROS
• Serología Borrelia burgdorferi ELISA Helica
  Biosystems, Inc.
• PCR Sangre y líquido sinovial
• GARRAPATAS
• PCR Glándula salival e intestino.
• Iniciadores Fragmentos de genes codificantes
  de B. burgdorferi sensu lato
• a) Flagelina (FLA) 256 pb
• b) Proteína A de la
  superficie externa (OspA) 345 pb

15
SEROLOGÍA DE Borrelia burgdorferiPUNTO DE CORTE
Densidad öptica
Sensibilidad 95.8 Especificidad 94.7 Punto
de corte 0.300 DO (Densidad óptica)
16
1. Tamaño de muestra
ANÁLISIS ESTADÍSTICO

n tamaño de muestra, resultando 384 por cada
grupo de estudio. ? estimador de varianza
máxima 50 Z valor de tablas 1.96 d
precisión 5 (Scheafer et al., 1987)
2. Se estimó la prevalencia y su intervalo de
confianza mediante el estimador Rogan-Gladen
(Greiner y Gardner, 2000). 3. Para evaluar la
asociación de los factores de riesgo con la
seropositividad a B. burgdorferi se utilizaron
la razón de probabilidades (Odds ratio, OR) y X2
de Mantel-Haenszel. 4. Todos los análisis
estadísticos utilizando el paquete SAS
(Statistical Analysis System) para Windows ver
8.2 (Walker, 1997 SAS, 2004).
17
Seroprevalencia ajustada de Borrelia burgdorferi
ELISA Helica Biosystems, Inc.
RESULTADOS
Perros atendidos en clínicas veterinarias
24/384 6.8 (95 CI 3.5-8.9) Perros
capturados por los centro de control animal
42/384 12.0 (95 CI 7.5-14.3) Ambos
grupos 66/768 9.3 (95 CI
6.3-10.6)
18
FACTORES DE RIESGOPerros de las clínicas
veterinarias
Parámetro
X2 P OR (95 IC )
Edad 5.2724 0.02 4.7
(1.1-20.6) Falta de programa
preventivo 7.8519 0.005 4.9 (1.4 -16.8)
19
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 26 de septiembre de 2007 PCR
de FLA en sangre de perros seropositivos
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
20
256 pb
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
256 pb
41 42 43 44 45 46 47 48 49
256 pb
20
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 29 de septiembre de 2007 PCR
de FLA en tejidos de perros seropositivos
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16
256 pb
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30
256 pb
21
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Manhattan, Kansas, 30 de septiembre de 2007 PCR
de OspA en tejidos, coágulos sanguíneos y
garrapatas de perros seropositivos
1 2 3 4 5 6 7
8 9 10 11 12 13
345 pb
1. Marcador 2. C N40 3. 506
Coágulos sanguíneos Sero FLA 4. 2032
Coágulos sanguíneos Sero FLA 5. 675
Coágulos sanguíneos Sero FLA 6. 1312
Coágulos sanguíneos Sero FLA 7. 1272
M, sinovial Sero FLA 8. 1326 M,
sinovial Sero FLA 9. ENS1 M,
sinovial Sero FLA 10. 39 CA M,
sinovial Sero FLA 11. 1165 Garrapatas
Sero FLA 12. 1346 Garrapatas Sero
FLA 13. C-
22
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Mexicali, B.C., 22 de octubre de 2007 PCR de FLA
en tejidos de perros seropositivos
M 1 2 3 4 5 6 7 P N M
256 pb

23
EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR
Mexicali, B.C., 19 de marzo de 2008 PCR de FLA
en tejidos y garrapatas de perros seropositivos

• M. Marcador BioLadder 100
• 889 Coágulos sanguíneos
• 2063 Coágulos sanguíneos
• 1272 Coágulos sanguíneos
• 1368 Garrapatas
• 1368 Garrapatas
• 1368 Garrapatas
• 1368 Garrapatas
• 1272 Vejiga
• 1272 Vejiga
• 1272 Vejiga
• 1272 Vejiga
• P. Positivo
• N. Negativo
• M. Marcador BioLadder 100

M 1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 P N M
256 pb

24
EVIDENCIA DE Borrelia burgdorferi -
SecuenciaciónManhattan, Kansas, 17 de octubre de
2007
Perro 1312  Muestra Coágulo sanguíneo 100 de
identidad con OspA de Borrelia burgdorferi TAACA
ATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGG
CAAAA
TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACAC
TTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA CACTAGTATCaaaaaaaGTAA
CTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG

CACTAGTATCAAAAAAAGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGA
AAAATTCAATG AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGC
AGACGGAACCAGACTTGAATACA
AAAAAGGTGAAGTAT
CTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA CAG
AAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTAT
GTTCTTG
CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGC
TAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG AAGGAACTCTAACTGCTGA
AAAAACAAC AAGGAACTCTA
ACTGCTGAAAAAACAAC
25
2. AISLAMIENTO

• Medio de cultivo BSK-H SIGMA suero de
  conejo (6) gelatina de cerdo (6)
  rifampicina (100 mg/L) fosfomicina (50 mg/L)
  anfotericina B (2.5 mg/L)
• Fuente Vejiga.
• Temperatura 33C
• Comprobación de crecimiento Microscopia de
  campo obscuro
• Criopreservación -20C (CryoCare Bacterial
  Preservers Key Scientific Products)
• Secuenciación 99 Borrelia burgdorferi sensu
  stricto

26
3. TRANSMISION EXPERIMENTAL

• 3 perros sanos de 8 meses de edad, de talla
  mediana, pelaje corto.
• a) Grupo A 2 perros expuestos a R. sanguineus
  con B. burgdorferi.
• b) Grupo B 1 perro expuesto a R. sanguineus no
  infectadas.

27

• Incubación y desarrollo de R. sanguineus
• Recolección de hembras adultas repletas recién
  alimentadas.
• Preovoposición 4 d.
• Ovoposición 5 d.
• Incubación de huevos 11 d.
• Ayuno 3 d.
• Colocación de larvas en perros 3 d.
• Muda de larvas a ninfas 7 d.
• Ayuno 3 d.
• Colocación de ninfas en perros 4 d.
• Muda de ninfas a adultas 11 d.
• Ayuno 2 d.
• Inoculación de borrelias en hembras adultas 1
  d.
• Colocación de garrapatas adultas en perros 7
  d.
• Total del ciclo 61 d.
• Incubación 30C con 80 de humedad.

28

• CICLO DE R. sanguineus EN MEXICALI

29

• Inoculación de B. burgdorferi en R. sanguineus
• 5 hembras adultas inoculadas/perro.
• El inóculo fue por capilaridad con medio BSK-H y
  Borrelia burgdorferi.
• Concentración 1108 espiroquetas/ml de BSK-H.
• En cámara húmedad a 34C durante 24 horas.

30

• Exposición experimental en perros a R. sanguineus
  
• infectadas con B. burgdorferi
• Colocación de 5 machos y 5 hembras
  adultas/perro.
• Duración 7 días.

31

• CONCLUSIONES
• Seroprevalencia de 6.8 (95 IC 3.5-8.9) a B.
  burgdorferi en perros atendidos en clínicas
  veterinarias.
• Seroprevalencia de 12 (95 IC 7.5-14.3) en
  perros capturados por los centros de control
  animal.
• Perros 1 año de edad OR 2.7 (95 IC 1.2-6.1).
• Perros que no tuvieron acceso a un programa
  preventivo OR 4.9 (95 IC 1.4-16.8).
• Evidencias serológicas y moleculares confirman la
  existencia de B. burgdorferi en perros y
  garrapatas en donde sólo se han registrado R.
  sanguineus.
• Hasta el momento no se ha comprobado la
  transmisión de B. burgdorferi por garrapatas
  adultas de R. sanguineus en perros utilizando el
  protocolo para Ixodes scapularis.

32

• Modificación del protocolo de la transmisión
  experimental de B. burgdorferi a través de R.
  sanguineus
• Utilizar 5 µL de medio BSK-H con 1108
  espiroquetas/ml como inóculo en lugar de 20 µL.
• Realizar la inoculación de borrelias incluyendo
  la fase de ninfa no sólo la adulta.
• Inocular con borrelias a 30 garrapatas hembras en
  lugar de 5 por cada perro de experimentación.

33

• GRACIAS

Mexicali, Baja California, México
Tinoco.luis_at_yahoo.com