PCR

1

• PCR
• Scelta dello stampo
• Scelta dei primer

2
PCR da DNA genomico
3
PCR da mRNA (RT-PCR)
4
Uso dei linkers
5
Vettori dAdT
3
5
3
5
5
3
3
5
6
PCR da DNA genomico
7
Proteine di fusione
prom
Tag o rep.
term
cDNA
trascrizione traduzione
8
(No Transcript)
9
Elettroforesi di acidi nucleici

• Gel di agarosio
• Gel di acrilammide

10
(No Transcript)
11
(No Transcript)
12
Elettroforesi su gel di agarosio
13
(No Transcript)
14
Tamponi di elettroforesi
15
Soluzioni di caricamento
16
Soluzioni di caricamento

• Aumentano la densità del campione
• Colorano il campione
• Rendono visibile la corsa elettroforetica

17
Migrazione del DNA su gel
18
Fattori che influenzano la migrazione

• Peso molecolare
• Concentrazione di agarosio
• Conformazione DNA
• Voltaggio applicato
• Intercalanti
• Tampone di elettroforesi

19
Visualizzazione del DNA
20
Marcatori di peso molecolare
? HindIII
21
Fotodocumentazione
22
(No Transcript)
23
Recupero DNA da gel

• Elettroeluizione
• Agarosio low melting
• Solubilizzazione agarosio

24
Gel di acrilammide
25
Apparato per gel di acrilammide
26
Metodi di sequenziamento

• Sanger (enzimatico)
• Maxam e Gilbert (chimico)

27
(No Transcript)
28
(No Transcript)
29
Metodo di Sanger
primer
quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi
ddTTP
ddCTP
ddGTP
ddATP
primer
nuovo DNA
dideossinucleotide terminatore
La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP
è incorporato al posto di un dNTP
Denaturare e separare su gel di poliacrilammide
30
Metodo di Maxam e Gilbert
DNA singolo filamento marcato ad una estremità
32P
4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche
Es. metilazione delle G con dimetilsolfato
Rottura del filamento in corrispondenza della
base modificata mediante piperidina
Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide
31
Gel di poliacrilammide di sequenza
32
(No Transcript)
33
Fasi di un progetto di sequenziamento

• clonaggio e preparazione del DNA
• reazioni di sequenza
• elettroforesi su gel di poliacrilammide
• interpretazione e raccolta dati

34
Vettori a singolo filamento
35
Fagemidi
36
Strategie di sequenziamento

• Primer specifici consecutivi
• Delezioni progressive
• Frammenti casuali (shotgun)

37
Reazioni base-specifiche
38
Confronto metodi di sequenziamento
Sanger ?rapida e semplice attuazione ?disponibilità di kit ?necessità di primer ?sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert ?lunga preparazione del DNA ?reazioni da mettere a punto ?relativamente economico ?strutture non influenti ?utilizzabile per oligonucleotidi
39
Sequenziamento automatico
40
Sequenziamento con Taq polimerasi