M

1
Métodos aplicados para ?-caroteno
Universidad de Chile Facultad de Ciencias
Químicas y Farmacéuticas Dpto. Ciencia de los
Alimentos y Tecnología Química Química de
Alimentos y Materias Grasas
Taller FAO, 2008

• Dra. Paz Robert C.

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Estructura básica

• Tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal
  formado a partir de 8 unidades isoprenoides de 5
  C unidas de manera tal que el orden se invierte
  en el centro.
• Amplio sistema de doble enlace conjugado.

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Análisis de Carotenoides
Dependiendo del grado de información deseado
?-caroteno Provitamina A
Composición completa
Provitamina A Carotenos principales
4
(No Transcript)
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Características espectrales
Espectro de absorción de carotenoides son
dependientes del solvente
1A1cm usado en el cálculo de la concentración
también varía marcadamente con el solvente
Caroteno Solvente ?max ?max ?max 1A1 cm
?-caroteno Acetona (429) 452 478 -
cloroformo (435) 461 485 2396
etanol (425) 450 478 2620
hexano (425) 450 477 2592
Carotenoides en solución obedecen la Ley de
Lambert-Beer. Su absorbancia es directamente
proporcional a la concentración.
Britton, 1995 Rodriguez-Amaya. 2001
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POSIBLE ESQUEMA DE DEGRADACIÓN DE CAROTENOS
Moléculas altamente insaturadas
TRANS CAROTENO
isomerización
oxidación
EPOXICAROTENOS APOCAROTENOS
CIS-CAROTENOS
oxidación
Pérdida de color Pérdida valor nutritivo Pérdida
de sabor
COMPUESTOS DE BAJO PESO MOLECULAR
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• ... Isomerización cis
• causa leve pérdida de color, disminución de 2 a 6
  nm en la ?, aparición de un pick en la región UV

Licopeno
trans
15-cis
13-cis
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Procedimiento Analítico

• Muestreo y preparación de la muestra
• Extracción con acetona en frio
• Transferencia (partición) a éter de petróleo,
  hexano, eter etílico
• Saponificación y lavado
• Concentración en evaporador rotatorio (lt35C)
• Separación cromatográfica
• Identificación y cuantificación.

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Muestreo y preparación de la muestra.

1. Homogenización de la materia prima
2. Extracción con acetona en frío

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Partición a éter de petróleo
11
Separación OCC
FM porcentajes crecientes de acetona en éter de
petróleo
MgO Celite (11)
Espectro de absorción UV/VIS, Rf, orden de
elución cromatográfica reacciones específicas.
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Fases Estacionarias-OCC

• Alúmina
• Sílica
• CaCO3
• Ca(OH)2
• MgO
• ZnCO3
• Tierras silíceas (tierra de diatomeas,
  kieselguhr, hyflosupercel)
• Celulosa, almidón, dextran cross-linked
  (sephadex), Polietilen
• Mezclas de ellos

Rodriguea-Amaya, 2001
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Criterios de identificación OCC

• Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el
  cromóforo sugerido
• Propiedades cromatográficas concordantes en dos
  sistemas diferentes. Orden de salida OCC y
  Rf(TLC).
• Estructura fina del espectro
• (III / II)100

Britton, 1995
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Espectro de absorción ?max

• zeinoxantina 421 445 474
• ?-criptoxantina 421 445 475
• Luteina 421 445 475

15
Espectro de absorción ?max

• ?-criptoxantina (425) 449 476
• zeaxantina (424) 449 476

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Métodos Oficiales AOAC

• Carotenos en plantas frescas Ch-45 (941.15)
  /método espectrofotométrico.
• Carotenos y xantofilas en plantas secas y
  alimentos mezclados Ch-45 (970.64)/ método
  espectrofotométrico
• Carotenos y carotenoides en productos de macaroni
  Ch-32 (938.04)
• Carotenos y carotenoides en huevos Ch-32 (938.04)

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Carotenos en plantas frescas

• Pigmentos solubles en grasa, extraídos y
  cromatografiados para remover clorofilas e
  hidroxicarotenos, los cuales son determinados
  espectrofotométricamente y expresados como
  beta-caroteno

MgOhyflosupersel (11)
18
Carotenos y xantofilas en plantas secas y
alimentos mezclados
Silica gel Ghyflosupersel (11)
MgOhyflosupersel (11)
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Separación-HPLC

• Fase inversa-Fases enlazadas
• RP-18 ó C18
• RP-8 ó C8
• C-30
• Ntrilo, amino

• Fase Inversa-HPLC
• Columnas enlazadas RP-18 Aplicable a
  carotenoides de todos los niveles de polaridad.
• Materiales RP son inertes, formación de
  artefactos es mínima.
• Se puede trabajar en elusión con gradiente

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Separación-HPLC

• Fase Normal
• Ca(OH)2
• Alúmina
• Sílice

• Fase Normal
• Sílice
• compuestos son eluídos de acuerdo a su polaridad,
  útil para separación de xantofilas, los carotenos
  son pobremente resueltos
• Alúmina, Ca(OH)2
• Para algunas separaciones especiales. Presentan
  dificultades prácticas tienen una vida corta y
  necesitan un control riguroso de humedad

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Criterios de identificación-HPLC

• ?Tiempos de retención tr
• ?Tiempo de retención relativo
• TRR tr,i / tr,st
• ?Adición a la muestra del componente supuesto
  normalmente se agrega a la muestra, el supuesto
  componente i y se ve cual pico crece.
• ?Correlaciones gráficas de estructura -retención

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Criterios de identificación HPLC

• ?Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el
  cromóforo sugerido
• ?Propiedades cromatográficas concordantes en dos
  sistemas diferentes.
• ?Espectro de masas que confirme por lo menos la
  masa molecular.

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Cuantificación

• ?Curva de calibración
• ? Comparación con muestras de concentración
  conocida
• Cs/Cst As/Ast
• Standard Interno
• Fi (Ci/Cst) (Ast/Ai)

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Rosa mosqueta (Rosa Rubiginosa)
Características espectrales de carotenoides
identificados
Fracción
Fase movil
Identificación
Rf
Máx long de onda
Máx long de onda
Literatura
1
5 acetona
(426)
448
476
B-Caroteno
0,98
(425)
450
477
2
10 acetona
(422)
444
472
Zeinoxantina
0,43
421
445
475
3
20acetona
450
Apocarotenal prob.
0,98
4
30-40 acetona
(424)
442
468
Anteroxantina prob
0,19
(422)
445
472
5
60 acetona
(422)
442
472
Luteína
0,19
(421)
445
474
zeaxantina
(424)
449
476
6
100 acetona
432
458
488
Rubixantina
0,52
434
460
490
7
10 agua-acetona
442
468
500
Licopeno
0,98
444
470
502
Davies, 1976 Rodriguez-Amaya, 1999
Placa de sílice, FM metanol 5 en benceno
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HPLC (Rosa Mosqueta)
Rubixantina
Licopeno
?-caroteno
Columna RP-18 symmetry, 5u, 250 mm Fase móvil
acetonitrilo metanol acetato de etilo (65 20
15) Flujo 1ml/min
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Tomate
Zanahoria
Identificación por Trr con patrones extraídos.