Gel-Filtration Chromatography

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XXI Congresso Nazionale 24 Giugno 2011 Proposta
nuovi protocolli clinici SIUrO e update protocolli
PSA-IgM
Andrea B. Galosi Clinica Urologica, Ospedali
Riuniti, Ancona
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TITOLO
Accuratezza diagnostica dellimmunocomplesso
PSA-IgM nella diagnosi precoce del carcinoma
prostatico
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Studio PSA-IgM

• Studio spontaneo
• Osservazionale
• Prospettico
• Multicentrico
• Test diagnostico

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PSA-IgM Razionale

• Gli immunocomplessi rappresentano una nuova
  classe di biomarcatori con un maggiore potenziale
  diagnostico, se comparato al biomarcatore libero
  corrispondente.

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La recente scoperta di immunocomplessi formati da
immunoglobuline della classe M (IgM) e
biomarcatori tipici della neoplasia epatica e del
colon retto (SCCA e CEA)

• Pontisso P, Quarta S, Caberlotto C, Beneduce L,
  Marino M, Bernardinello E, Tono N, Fassina G,
  Cavalletto L, Gatta A, Chemello L - Progressive
  increase of SCCA-IgM immune complexes in
  cirrhotic patients is associated with development
  of hepatocellular carcinoma. Int J Cancer, 2006,
  119735-40
•  
• Castaldi F, Marino M, Belluco C, De Marchi F,
  Mammano E, Nitti D, Lise M, Fassina G - Detection
  of circulating CEA-IgM complexes in early stage
  colorectal cancer. Int J Biol Markers, 2005, 20
  204-8.
•  
• Beneduce L, Castaldi F, Marino M, Quarta S,
  Ruvoletto M, Benvegnù L, Calabrese F, Gatta A,
  Pontisso P, Fassina G -Squamous cell carcinoma
  antigenIgM complexes as novel biomarkers for
  hepatocellular carcinoma. Cancer, 2005, 103
  255865.
•  

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Il ruolo delle IgM
Le IgM multivalenti sono considerate la
principale componente dellimmunità innata,
essendo capaci di legarsi ad un ampio range di
antigeni tumorali
I biomarcatori tumorali possono formare
immunocomplessi circolanti, costituiti dal
biomarcatore associato alle IgM, riscontrabili
nel siero dei pazienti.
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Immunocomplessi la teoria dell
Immunosorveglianza
PSA-IgM Razionale
Limmunosorveglianza tumorale prevede che il
sistema immunitario possa riconoscere e
distinguere gli antigeni tumore-specifici
(immunoediting) dagli effettori immunitari nativi
o adattativi e, nella maggior parte dei casi,
distruggere le cellule tumorali prima che esse
diventino clinicamente rilevabili.
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Le 3 fasi dellImmunoediting
PSA-IgM Razionale

• Nella fase di eliminazione il sistema
  immunitario riconosce le cellule tumorali e le
  annienta completamente o parzialmente.
• Nella fase di equilibrio il tumore e il sistema
  immunitario si neutralizzano.
• Nella fase di fuga si selezionano delle
  varianti cellulari tumorali che sono in grado di
  evadere la risposta immunitaria, la
  proliferazione delle cellule tumorali sfugge al
  controllo del sistema immunitario e il tumore
  continua a crescere.

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Limmunoediting è un processo dinamico costituito
da 3 fasi eliminazione, equilibrio e fuga
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IMMUNOCOMPLESSI PSA-IgM, UNA NUOVA CLASSE DI
BIOMARCATORI PER IL CANCRO ALLA PROSTATA
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Distribuzione dei levelli di PSA-IgM (cut off
145,1 AU/mL)
Beneduce et al. Cancer Detection and prevention
2007, 31402-407
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Confronto tra il PSA con cut-off 4 e 10 ng/mL ed
il PSA-IgM

• Specificità del PSA-IgM (88) rispetto al PSA 4
  (SP 4) e al PSA 10 (SP 71)
• Sensibilità di PSA-IgM (40) rispetto al PSA 10
  (22) è quasi raddoppiata
• Uso combinato di PSA-IgM e PSA 10 porta i livelli
  di sensibilità e specificità rispettivamente al
  60 e al 63 (7)

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(No Transcript)
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Determinazione PSA-IgM tramite metodica ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Anticorpo PRIMARIO anti-PSA
Campione da analizzare
Anticorpo SECONDARIO anti-PSA-IgM coniugato con
PEROSSIDASI
Cromogeno
Intensità del pozzetto ? PSA-IgM
next gtgt
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Disegno dello studio

• Multicentrico prospettico
• Analisi di una coorte di 150 pazienti destinati a
  re-biopsia prostatica, in precedenza sottoposti a
  prima biopsia, con esito negativo

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Obiettivo primario

• Verificare lutilità diagnostica del PSA-IgM come
  indicatore della presenza del carcinoma nella
  seconda biopsia
• Sensibilità e specificità, VPP, VPN
• Accuratezza diagnostica

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Obiettivi secondari

1. Correlazione con il Gleason score bioptico
2. Correlazione allo stadio clinico (TNM)
3. Validazione del valore ottimale di cut-off
   (definito dalla curva ROC)
4. Correlazione con la categoria di rischio clinico
   (NCCN 2010) e allevoluzione clinica       

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CRITERI DI INCLUSIONE

• Se il valore di PSA è costantemente superiore a
  10 ng/mL
• Quando la PSA velocity è superiore a 0.75
  ng/mL/anno
• In presenza di ASAP o HGPIN
• Se la prima biopsia risulta inadeguata (meno di 6
  prelievi, assenza di ghiandole prostatiche,
  frammenti troppo piccoli o non leggibili)
• Prelievi ematici presso la struttura ospedaliera
  (Emocromo, PT, PTT, eventuale ripetizione del PSA)

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CRITERI DI ESCLUSIONE

• Neoplasie concomitanti
• Malattie auto immuni
• Infezioni clinicamente in atto
• Terapia cortisonica
• Terapia immunosoppressiva
• Trattamento con inibitori 5-alfa redattasi
• Pazienti che non eseguono prelievi ematici
  preliminari alla biopsia presso la struttura
  ospedaliera

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ANALISI STATISTICA( by L. Pappagallo)

• Statistica Descrittiva
• Curve ROC
• PSA-IgM, cut off 145 AU/mL
• 30-40 paz veri positivi è la stima attesa dei paz
  con CaP individuati nei 150
• semi-ampiezza dellinterv.conf.(assunto come
  misura del grado di precisione delle stime di
  sensibilità e specificità) è circa 8.
• Potenza statistica 90 per incrementi di
  sensibilità/specificità compresi tra 10 e 15,
  partendo da valori attesi (ipotesi nulla) di 80
  e 50 rispettivamente.

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PSA-IgM

• Lo studio prevede di raccogliere del siero del
  paziente, che fa parte di un prelievo di sangue
  programmato e necessario alla regolare pratica
  clinica.
• Tale prelievo ematico è necessario e preliminare
  alla biopsia prostatica
• test emocagulativi,
• emocromo ed eventuale ripetizione del PSA

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PSA-IgM

• Il prelievo ematico
• NON deve essere eseguito per il solo PSA-IgM
• Rientra nella routine del centro
• Segue i protocolli assistenziali e la copertura
  assicurativa ospedaliera
• Segue le modalità stabilite senza devianze dai
  protocolli vigenti presso le singole strutture

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RECLUTAMENTO

• Paziente idoneo alla re-biopsia
• Foglio informativo di partecipazione
• Prelievo ematico eseguito presso struttura per
  accertamenti pre-biopsia donazione di 10ml di
  sangue ai fini dello studio
• Consenso
• Non è previsto nessun tipo di compenso economico
• I risultati del test saranno comunicati alle
  visite di controllo dal Suo urologo, ma non
  influenzeranno alcuna decisione terapeutica.
• semplice gesto potrà aiutare chi, come Lei, è
  affetto da questa patologia

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Centri Partecipanti

1. Centro Regionale indicatori biochimici di tumore
   Venezia (Gion M.)
2. Ospedale Ca Foncello Treviso (Fandella A.)
3. Ospedale S. Orsola Malpighi Bologna (Bertaccini
   A, Schiavina R, Marchiori D.)
4. Villa Tiberia Roma (Vincenti G.)
5. Presidio Sanitario Grandenigo Torino (Squeo
   M.S.)
6. Ospedali Riuniti di Ancona (Galosi A.)
7. Policlinico G.B. Rossi Verona (Novella G.)
8. I.N.R.C.A. Ancona (Pierangeli T.)
9. Clinica Urologica di Novara (Marchioro G.)
10. Urologia Torvergata Roma (Virgili G.)
11. Urologia S. Raffaele Milano (Nava D.L.)
12. Ospedali Riuniti di Bergamo (Roscigno M.)
13. Ospedale di Asti (Cussotto M.)
14. Ospedale di Forlì (Gunelli R.)
15. Ospedale di Castellanza Varese (Consonni P.)
16. Ospedale di Fidenza Parma (Benecchi L.)
17. Azienda Universitaria Federico II Napoli
    (Montanaro V.)
18. Policlinico Universitario di Palermo (Serretta
    V.)
19. Istituto Tumori Regina Elena (Canitano S,
    Sentinelli S.)

Coordinatori ScientificiBertaccini - Fandella -
Galosi - Gion
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COSTI

• Spese sostenute dalla SIURO
• Approvazione comitati etici
• Spedizione
• Analisi
• Kit dosaggio
• Raccolta CRF
• Analisi dei dati
• Assenti i costi aggiuntivi per Ospedale
• Assenti i costi assicurativi addizionali
• Polizza ospedale per prelievo ematico
• Non prevede finanziamenti, né compensi per gli
  sperimentatori

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D.L. 14.7.2009

• Il Decreto Legislativo del 14 Luglio 2009
  riguardante i requisiti minimi per le polizze
  assicurative a tutela dei soggetti partecipanti
  alle sperimentazioni cliniche dei medicinali
• Art. 4 si chiarisce che tali criteri non sono
  applicabili agli studi osservazionali.

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Time Table

• Gennaio 2011
• Approvazione Comitato Etico centro coordinatore
• Ospedali Riuniti, Ancona, Maggio 2011
• Ready to start Ancona
• Attivazione di altri centri
• Attivazione del Laboratorio Centrale di Venezia
• Reclutamento (10 casi /centro 200 casi) ed
  analisi dei dati
• Report SIUrO Bologna 2012

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Raccolta - Analisi - Spedizione

• Prelievo ematico 5 ml di sangue da distribuire in
  una provetta con separatore di siero integrato
  SST II Advance gel acrilico Silice micronizzata.
• Centrifuga 1.500g (3200RPM) x per 10-20 min a
  temperatura ambiente (20-25C)
• Stoccare a - 80C, (in alternativa a - 20 per
  non più di 6 mesi) il siero così ottenuto in
  provette criogeniche con tappo a vite da 2 ml.
• Le analisi saranno centralizzate in unico
  laboratorio.

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Identificazione della provetta
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PROTOCOLLO DI TRASPORTO

• Tutti i materiali biologici devono essere
  trasportati
• In contenitori con ghiaccio secco che
  garantiscano una temperatura controllata per
  almeno 48 ore.
• Corriere TNT
• I codici identificativi del pacco e del trasporto
• Documento che fornisca la tracciabilità
• Le spedizioni saranno effettuate dal lunedì al
  mercoledì

Dr. Gion Massimo Ospedale Civile di
Venezia Castello 6777 30122 Venezia
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Disponibili alla partecipazione

1. Bertaccini, Schiavina, Marchiori, Martorana
2. Benecchi
3. Canitano
4. Consonni
5. Cussotto
6. Fandella
7. Galosi, Muzzonigro
8. Gunelli
9. Marchioro
10. Martino

1. Montanaro
2. Nava
3. Novella
4. Pierangeli
5. Roscigno
6. Serretta
7. Sentinelli
8. Squeo
9. Vincenti
10. Virgili

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FASE 5 analisi dei dati

• Lultima fase prevede la costruzione della curva
  standard dai valori di OD del calibratore. Le
  concentrazioni dei campioni vengono estrapolate
  dalla curva.
• La concentrazione di PSA-IgM viene espressa in
  unità arbitrarie (AU) per mL (AU/mL).

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PSA-IgM

• Le procedure diagnostiche corrispondono alla
  pratica clinica corrente e non alterano la
  gestione clinica del paziente