Pr

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Présentation du Dr Hanna SOVALATde lInstitut de
Recherche en Hématologie et Transplantation
MULHOUSEstage PAF Cytométrie en flux du
26/11/07
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Applications de la cytométrie en flux

• A Application en routine
• Immunophénotypage Expression quantitative
  dantigènes de surface ou intracellulaire
  (immunologie, hématologie)
• Quantification de lADN
• Étude du cycle cellulaire
• Viabilité cellulaire
• Apoptose
• B Application en recherche
• Flux calcique
• pH intracellulaire
• Potentiel de la membrane cytoplasmique et
  mitochondriale
• Mesure oxydatif
• Etc

cancérologie,pharmacologie et cytogénétique
Analyse des fonctions cellulaires
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Applications de la cytométrie en flux

• A.1/ Immunophénotypage (Analyse des antigènes)
• La réaction dimmunofluorescence associe la
  spécificité des anticorps monoclonaux et les
  propriétés des fluorochromes.
• Elle implique un anticorps fluorescent qui se
  lie spécifiquement à une molécule de surface ou
  intracellulaire.

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Applications de la cytométrie en flux
A.1/ Immunophénotypage Technique de marquage
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Applications de la cytométrie en flux
A.1/ Phénotypage Méthodes damplifications
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Applications de la cytométrie en flux

• A.1/ Immunophénotypage Les fluorochromes
  utilisés
• Un fluorochrome utilisable et analysable en CMF
  doit avoir les proprietés suivantes
• Absorber la lumière à des longueurs dondes
  existantes sur les lasers équipant le cytomètre.
• Avoir un différence de longueur donde suffisante
  entre labsorption et lémission maximale.
• Avoir un bon rendement quantique défini par le
  taux dénergie entre la lumière émise et la
  lumière absorbée
• Pouvoir être lié aux anticorps monoclonaux en
  gardant ses propriétés spectroscopiques après
  conjugaison.

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Applications de la cytométrie en flux

• Introduction de contrôles négatifs afin
  déliminer de lanalyse les éventuelles fixations
  aspécifiques des différents réactifs employés.
• Anticorps  non réactifs  de même isotype que
  lanticorps test.
• En fluorescence indirect, lanticorps secondaire
  couplé au fluorochrome doit être le même que dans
  léchantillon test.

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Applications de la cytométrie en flux
A.1/ Immunophénotypage Double immunofluorescence
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Applications de la cytométrie en flux
A.1/ Immunophénotypage Etude du phénotypage MDR
en clinique
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Applications de la cytométrie en flux
A.1/ Immunophénotypage Dosage des cytokines pour
étude du phénotype TH1/TH2
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Applications de la cytométrie en flux
A.1/ Immunophénotypage Dosage des cytokines
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Applications de la cytométrie en flux
A.1/ Immunophénotypage Dosage des cytokines
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Applications de la cytométrie en flux
A.1/ Immunophénotypage Etude du phénotypage MDR
en clinique
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Applications de la cytométrie en flux

• A.2/ Quantification de lADN
• Les cellules eucaryotes sont caractérisées par un
  compartiment nucléaire (noyau) renfermant la
  totalité de lADN génomique.
• Le contenu en ADN est caractéristique dune
  espèce cellulaire, et sa variation peut indiquer
  un état dactivation normal (réplication des
  chromosomes en cours de division cellulaire), ou
  anomalie de structure de lADN nucléaire (cas de
  certains cancers).

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Applications de la cytométrie en flux

• A.2/ Quantification de lADN Fluorochromes
  utilisés
• Lutilisation dun colorant spécifique de lADN
  permet de mesurer quantitativement son contenu
  pour chaque cellule.
• 2 groupes de fluorochromes
• Fluorochromes spécifiques des paires de bases de
  lADN A-T ou G-C
• Hoechst 3342
• DAPI
• Fluorochromes intercalant
• Iodure de propidium
• Bromure déthidium
• Acridine orange

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Applications de la cytométrie en flux
A.2/ Quantification de lADN
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Applications de la cytométrie en flux
A.3/ Cycle cellulaire Observation des cellules
au microscope
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Applications de la cytométrie en flux

• A.3/ Cycle cellulaire
• On peut diviser lensemble des évènements
  biochimiques qui président à la prolifération
  cellulaire en 4 étapes du cycle cellulaire
• PhaseG1 Activation de la cellule, préparation à
  la réplication de lADN
• Phase S (Synthèse) Réplication du matériel
  génétique
• Phase G2 La cellule duplique son matériel
  génétique
• Phase M (Mitose) Succession dévènements
  (prophase, prémétaphase, métaphase, anaphase,
  télophase et cytodiérèse) pour donner la
  naissance de 2 cellules filles

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Applications de la cytométrie en flux
A.3/ Cycle cellulaire
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Applications de la cytométrie en flux
A.3/ Cycle cellulaire
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Applications de la cytométrie en flux
A.4/ Viabilité cellulaire
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Applications de la cytométrie en flux
A.5/ Apoptose
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Applications de la cytométrie en flux
A.5/ Apoptose
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Applications de la cytométrie en flux
A.5/ Apoptose
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Applications de la cytométrie en flux
A.5/ Apoptose
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Applications de la cytométrie en flux
A.5/ Apoptose
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Applications de la cytométrie en flux
A.5/ Apoptose
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Applications de la cytométrie en flux
A.5/ Apoptose
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Applications de la cytométrie en flux

• B.1/ Applications en recherche Flux calciques
• Létude des flux calciques est dune très grande
  importance en biologie cellulaire.
• Le calcium joue un rôle de médiateur de
  transduction des signaux dans la membrane
  plasmique.

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Applications de la cytometrie en flux
B.1/ Flux calciques Les fluorochromes développés
pour analyser les flux calciques sont
facilement incorporés dans les cellules.
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Applications de la cytométrie en flux

• Des applications très nombreuses ont été
  développées
• Possibilité de détecter des hétérogénéités dans
  lactivation
• Des sous populations lymphocyaires
• De glioblastome par PDGF
• De plaquette par lalpha-trombine
• Étude de linduction de la prolifération au cours
  du vieillissement
• Analyse des effets pharmacologiques des
  substances au cour de la différenciation dans les
  cellules tumorales

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Applications de la cytométrie
B.1/ Applications en recherche Flux calciques
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Applications de la cytométrie

• B.2/ Application en recherche Le pH
  intracellulaire
• Le pH de lorganisme est contrôlé de manière
  stricte et varie peu.
• Il en va de même au niveau cellulaire et
  intracellulaire.
• Le pH intracellulaire joue un rôle important dans
  plusieurs processus métaboliques et par
  conséquent dans lhoméostasie cellulaire.
• Le système déchange, électriquement neutre,
  Na/H est principalement responsable de la
  régularisation du pH intracellulaire permettant à
  une cellule normale au repos, davoir un pH
  denviron 7,2.
• Principales causes de laugmentation du pH
  intracellulaire
• Sous leffet de stimuli pharmacologiques comme
  les esters de phorbols
• Lactivation cellulaire avec des mitogènes
• Au cours de la phase S du cycle cellulaire (pH
  compris entre 7,4 et 7,5).

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Applications de la cytométrie en flux

• B.2/ Applications en recherche Le pH
  intracellulaire
• Le mouvement dions intracellulaires dus à des
  modifications de flux protoniques sont
  actuellement étudiés par cytométrie en flux.
• Les sondes fluorescentes des flux protoniques
  excitées à 488nm (Laser à Argon)
• BCECF Sa fluorescence augmente avec le pH
  intracellulaire (env 25 canaux)
• SNARF Présente un déplacement de spectre en
  fonction du pH. Émission maximale à 570nm pour un
  pH de 6 et émission maximale à 640nM pour un pH
  de 9

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Applications de la cytométrie en flux
B.2/ Applications en recherchepH intracellulaire
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Applications de la cytométrie en flux

• B.3/ Applications de la recherche Potentiel de
  la membrane cytoplasmique et mitochondriale
• Les bases du potentiel transmembranaire
• Les cellules procaryotes et eucaryotes, même au
  repos maintiennent des gradients ioniques entre
  le milieux intra et extracellulaire pour les ions
  calcium, potassium, sodium et chlore.
• Dans les  potentiels transmembranaires  on
  distingue le potentiel plasmique, potentiel
  mitochondriale et plasmique.
• Le potentiel membranaire ( lintérieur est chargé
  négativement) varie de 10 à 90mV pour une cellule
  au repos.
• Le potentiel mitochondriale varie de 110 à 210mV.

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Applications de la cytométrie en flux

• B.3/ Applications de la recherche Potentiel de
  la membrane cytoplasmique et mitochondriale
• Le potentiel membranaire peut être calculé à
  condition que lon puisse déterminer les
  concentrations externes (dans le milieu) et
  internes (dans la cellule) de la sonde utilisé.
• En cytométrie en flux les mesures sont portées
  sur des comparaisons dintensité de fluorescence
  entre échantillons.
• On peut déterminer le potentiel maximal
  (hyperpolarisation) ou minimal (dépolarisation).

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Applications de la cytométrie en flux
B.3/ Applications de la recherche Potentiel de
la membrane cytoplasmique et mitochondriale
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Applications de la cytométrie en flux
B.3/ Applications de la recherche Potentiel de
la membrane cytoplasmique et mitochondriale
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Applications de la cytométrie en flux
B.4/ Applications de la recherche Mesure du
stress oxydatif

• Les activités enzymatiques constituent une part
  importante des réactions enzymatiques du
  métabolisme intermédiaire.
• Des altérations dans le déroulement des réactions
  enzymatiques produisent des dysfonctionnements
  majeurs dans la cellule.
• Ceci explique pourquoi ces activités sont
  régulierements étudiées au cours du processus de
  différenciation cellulaire.

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Applications de la cytométrie en flux
B.4/ Applications de la recherche Mesure du
stress oxidatif

• Les réactions oxydatives Les fluorochromes
  utilisés permettent de suivre des réactions de
  production danion superoxyde par NADPH-oxydase
  fixée dans la membrane.
• Les fluorochromes Les substrats utilisés sont
  dit  fibrinogènes  car ils acquièrent leur
  propriétés de fluorescence après un ou plusieurs
  clivages enzymatiques, dépendant de leur activité
  oxydatives
• DCFH-DA
• DHR 123
• Hydroéthidine

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Applications de la cytométrie en flux
B.4/ Applications de la recherche Mesure du
stress oxydatif
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Applications de la cytométrie en