Diapositiva 1

1
BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES
2
Colonizzazione cute Migrazione tratto
sottocutaneo Colonizzazione punta CVC
3
Microrganismi più frequentemente isolati
COMMENSALI della pelle Staphylococcus
epidermidis, S.aureus
Corynebacterium spp COMMENSALI del tratto
intestinale Escherichia coli
Klebsiella, Enterococcus Batteri
ambientali Pseudomonas aeruginosa
Sphyngobacterium spp Stenotrophomonas
spp COOMENSALE delle mucose Candida albicans
4
5 milioni di CVC impiantati ogni anno
250.000 infezioni associate a cateteri
12- 25 mortalità
Aumento della spesa ospedaliera da 3000 a 56167
per paziente
American College of Critical Care Medicine e
della Society for Healthcare Epidemiology of
America
5
(No Transcript)
6
ESEMPIO Central Venous Catheters greatest risk
of device-related infection infection rates of 3
to 5. Biofilms are universally present on
CVCs biofilm development outside of the
catheter or inner lumen Colonization and biofilm
formation may occur within 3 days of
catheterization
7
Metodi utilizzati per la determinazione
quantitativa della popolazione microbica adesa a
superfici rigide

• Metodi indiretti
• conta UFC di batteri eluiti con mezzi fisici
• colorazione batteri adesi e successivo
  saggio del colorante eluito
• radiomarcatura
• biologici

• Metodi diretti
• microscopia ottica
• elettronica (trasmissione, scansione)
• confocale

• Svantaggi presentati dai vari metodi
• impossibilità di distinguere tra cellule vive e
  morte
• possibile alterazione integrità cellulare
• possibile morte di parte della popolazione
  batterica
• distacco non garantito di tutte le cellule
• impiego di sostanze tossiche
• decadimento e diluizione dellisotopo
  radioattivo
• necessità di curve di correlazione per ogni
  microrganismo

8
METODI DIRETTI

• MICROSCOPIA OTTICA
• MICROSCOPIA ELETTRONICA
• MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE
• MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
• MICROSCOPIA CONFOCALE

9
MICROSCOPIA OTTICA

• SVANTAGGI E LIMITI
• Non distingue Vivi/Morti
• Porzioni di materiali

• VANTAGGI
• Facilità di esecuzione

Mai diagnostica, mai predittiva, sempre
complementare
10
MICROSCOPIA ELETTRONICA

• SVANTAGGI E LIMITI
• Non distingue Vivi/Morti
• Natura del materiale
• Porzioni di materiali
• Artefatti
• Non facile
• ANALISI QUALITATIVA
• NON SU BIOMATERIALI

• VANTAGGI
• Caratterizzazione strutture di adesione
• Localizzazione antigeni
• Visualizzazione di un fenomeno

11
MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE

• SVANTAGGI E LIMITI
• Non distingue Vivi/Morti
• Solo porzioni di materiale
• Non facile

• VANTAGGI
  
• Dettegli sullattaccamento microbico
• Osservazione anche del materiale opaco
• SOLO QUALITATIVA
  

12
MICROSCOPIA A FLUORESCENZA (CTC, ARANCIO DI
ACRIDINA, DAPI, RODAMINA 123)

• SVANTAGGI E LIMITI
• Incubazione/Preparazione del campione

• VANTAGGI
• Distingue Vivi/Morti con colorazioni
  differenziali (BacLight Live/Dead)

SYTO9 COLORANTE CATIONICO LIPOFILICO CHE PENETRA
ATTRAVERSO LE MEMBRANE E MARCA I BATTERI VIVENTI
CON UNA FLUORESCENZA VERDE IODURO DI PROPIDIO
COLORANTE ANIONICO CHE NON PENETRA LE MEMBRANE.
SE LE MEMBRANE SONO DANNEGGIATE O COMPROMESSE
(BATTERI UCCISI) PENETRA E MARCA CON UNA
FLUORESCENZA ROSSA
13
MICROSCOPIA CONFOCALE

• SVANTAGGI
• Non evidenzia interazioni Interno/Esterno
  materiale
• Solo porzioni di materiale

• VANTAGGI
• Illuminazione laser
• Materiale opaco e trasparente

14
METODI INDIRETTI PER LA DETERMINAZIONE DI
MICRORGANISMI ADESI

• Metodi di conta con distacco dei batteri
• METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE
• METODO DI CLERI
• METODO DI SHERETZ

• Metodi di conta in situ
• MARCATURA CON ISOTOPI
• SAGGI IMMUNOENZIMATICI
• SAGGI BIOLOGICI

15
Metodi colturali
Coltivazione in brodo di punta del catetere
Qualitativo
Vantaggi
Svantaggi
Non discriminante tra contaminazione colonizzazion
e infezione
Grande semplicità
Grande sensibilità
Non garantito lo sviluppo di tutte le specie
presenti
Impossibilità di determinare se presente più di
una specie
Necessaria la rimozione del catetere
16
METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE
Ampiamente utilizzato per cateteri venosi Semina
mediante striscio su opportuni terreni solidi
Rotolamento di punta del catetere su piastra per
4 volte
Semiquantitativo
Vantaggi
Svantaggi
Bassa specificità Bassa predittività
Grande semplicità
Facilità di esecuzione
Sviluppo di
Non garantito il distacco dei batteri
Microrganismi vivi
lt15 colonie
Coltivazione della sola porzione esterna
del catetere
Contaminazione
gt15 colonie
Necessaria la rimozione del catetere
Colonizzazione
17
METODO DELLA SONICAZIONE
Distacco dei microrganismi adesi o mediante
sonicazione o vortex
Coltivazione della punta e del segmento distale
del catetere
Semi-quantitativo (CRI)
Vantaggi
Svantaggi
Microrganismi vivi Sensibilità alta
Non garantita la vitalità ed il distacco dei
batteri
Sonicazione, vortex
Facilità di esecuzione
Non distingue tra colonizzatori parte esterna e
lume
lt102 colonie
Sviluppo di
Contaminazione
Necessaria la rimozione del catetere
gt102 colonie
Colonizzazione
18
SAGGI IMMUNOLOGICI ELISA

• SVANTAGGI E LIMITI
• Conoscenza del microrganismo
• Espressione dellantigene
  
• Semi-quantitativa
• Microrganismi in superficie
• Antigene nella forma plantonica è espresso?
• Curve di riferimento

• VANTAGGI
• No radioattivo

19
Metodi biologici
Correlazione tra un fattore batterico (ATP,
consumo di O2, produzione di CO2, ecc.) e numero
di batteri

• VANTAGGI
• No radioattivo
• Indipendente dallo stato del microrganismo
  (plantonico/sessile/biofilm)
• Distingue vivi da morti
• Nessuna manipolazione del supporto abiotico

• SVANTAGGI E LIMITI
• Curve di riferimento con metodo della conta delle
  UFC

20
Contenuto di ATP e numero di batteri

• SVANTAGGI E LIMITI
• Curve di riferimento con metodo della conta delle
  UFC
• Rottura dei batteri non sempre efficace

• VANTAGGI
• Indipendente dallo stato del microrganismo
  (plantonico/sessile/biofilm)
• Distingue vivi da morti

Correspondence curves between log
CFU-per-milliliter and log relative light unit
(RLU) mean values
21
IL METODO BIOTIMER

• Consente di determinare il numero di batteri
  adesi, aggregati o in biofilm, mediante un test
  biochimico e non mediante la classica
  determinazione del numero delle unità formanti
  colonia (UFC)
• Il BioTimer utilizza un terreno di coltura
  contenente un indicatore di pH (rosso fenolo),
  che vira dal rosso al giallo in seguito
  allacidificazione del terreno
• Il tempo richiesto per il viraggio
  dellindicatore viene correlato con il numero di
  cellule batteriche presenti inizialmente nel
  campione attraverso una curva di correlazione
  specifica
• Il nuovo metodo consente di determinare il numero
  di batteri in situ, senza manipolazione del
  campione

Ceppi utilizzati Streptococcus sobrinus
ATCC33478T Streptococcus oralis
ATCC35037T Escherichia coli MG1655
ATCC47076 Staphylococcus aureus
ATCC6538 Pseudomonas aeruginosa PAO1
22
Esempi di curve di correlazione tra tempo di
viraggio dellindicatore e numero dei batteri
presenti nel campione
Log UFC
Log UFC
Tempo (ore)
23
Metodi di valutazione dellattività degli
antibiotici in vitro
METODI PER DILUIZIONE in TERRRENO LIQUIDO o SOLIDO
1
METODI PER DIFFUSIONE in TERRENO SOLIDO
2
Concentrazione Minima Inibente
MIC
Concentrazione Minima Battericida
MBC
SOLO PER BATTERI IN FORMA PLANCTONICA !!!!!!!!!!!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! NON IDONEO PER BIOFILM
24
Sistema per la determinazione della minima
concentrazione per leradicazione del biofilm
(MBEC)
Calgary device
National Committee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS)
25
APPLICAZIONE DEL BIOTIMER NELLA DETERMINAZIONE
DIRETTA DELLA SUSCETTIBILITA AGLI ANTIBIOTICI DA
PARTE DI BATTERI ADESI IN BIOFILM A
CATETERI NESSUNA MANIPOLAZIONE DEL CAMPIONE
!!!!!!!!!!!!!