Assoziationen in dicht gepackter Umgebung und Excluded Volume Effekt

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Assoziationen in dicht gepackter Umgebung
undExcluded Volume Effekt

• 22.06.2004
• Ina Meiser

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Gliederung

• Einleitung
• Was ist excluded volume?
• Modell für makromolekulare dicht gepackte
  Umgebungen
• Beobachten von makromolekularen Reaktionen in
  dicht gepackter Umgebung
• Effekte von dicht gepackten Umgebungen auf
  Proteinfaltung
• Ausblicke

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Crowded Environment(dicht gepackte Umgebung)

• Zellen enthalten viele Makromoleküle die einen
  Großteil des Gesamtvolumens besetzen (10-40),
  sie sind also dicht gepackt
• crowded media oder auch volume-occupied media
• crowded ? konzentriert

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Probleme bei Experimenten

• in vivo bis zu einigen hundert g/l von
  verschiedenen Makromolekülen in einem
  biologischen Medium
• in vitro Medien stark verdünnt, selten ist die
  Konzentration höher als 1g/l und weniger
  Makromoleküle insgesamt
• ? Crowding kann durch Zufügen von
  synthetischen
• oder natürlichen Molekülen nachgeahmt
  werden
  
• (genannt crowders oder crowding agents)

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Excluded Volume(ausgeschlossenes Volumen)

• Grundlegendes Prinzip Gegenseitige
  Undurchdringlichkeit von Molekülen
• ? nur sterische Abstoßung als fundamentale
  Wechselwirkung
• Anschaulich Bechermodell

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Excluded VolumeKonsequenzen

• Für kleine T
• Erreichbares Volumen ist fast gleich dem
  unbesetzten
• Für große T
• erreichbares Volumen wird kleiner, Beitrag
  der räuml. Abstoßung zur reduzierten Entropie und
  steigenden freien Energie wird entsprechend größer

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Excluded VolumeEntropische Konsequenzen

• Minimierung des ausgeschlossenen Volumens
  bedeutet Reduzierung der freien Energie
• ? Konsequenz von Crowding
• Erleichterung von Prozessen die zu einer
  Abnahme des excluded volume führen
• Crowding wird die Assoziation von Molekülen
  erleichtern die schon die Tendenz haben sich
  zusammenzulagern, es wird diese Tendenz aber
  nicht de novo erzeugen

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Thermodyn. Modell für Vorhersage von Einflüssen
des excluded volume effects

• D.Hall, A. Minton Einfaches Modell mit starren
  globulären Proteinen die nur durch räumliche
  Abstoßung miteinander interagieren
• ? Experimentell gemesse Aktivitätskoeffizienten
  können erstaunlich korrekt geschätzt werden
  konnten

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Thermodyn. Modell für Vorhersage von Einflüssen
des excluded volume effects

• Allgem. Reaktionsgleichung
• r stöchiometrischer Koeffizient des
  Eduktes R
• p stöchiometrischer Koeffizient des
  Produktes P
• nicht idealer Faktor , ein zusammensetzungsabhän
  giges Maß für Interaktionen von gelösten Stoffen
  
• Thermodynamischer Aktivitätskoeffizient

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Anwendung des Modells

• Gelöstes globuläres Protein T dessen
  Aktivitätskoeffizient bestimmt werden soll
• Ein zweites globuläres Protein C als crowder, das
  einen Teil ? des Gesamtvolumens besetzt
• ?Starkes Ansteigen der Aktivitätskoeffizienten
  bei zunehmendem ausgeschlossenen Volumen

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BeispielEinfache Isomerisationsreaktion

• Reactant ? Product

• Jede Konformationsänderung die das effektive
  Volumen des gelösten Stoffes erhöht (z.B.
  Proteinentfaltung) wird schrittweise mit Zunahme
  des crowding inhibiert

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BeispielReaktion von n Monomeren zum n-Mer

• n Reactants ? Product

• Zusammenlagerung wird mit zunehmendem crowding
  erleichtert
• Ausmaß des crowding Effekts wächst mit
  zunehmendem Grad der Zusammenlagerung

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Zusammenfassung der Effekte auf Reaktionen in
crowded media
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Grenzen des Modells und mögliche Verbesserungen
(I)

• Solvent wird als Kontinuum angenommen
• ? effektives Interaktionspotential zwischen
  gelösten Stoffen ist unempfindlich gegenüber der
  molekularen Natur des Solvents
• Einfluss von soften Interaktionen
• ? können durch Vergrößerung der Partikelradien
  in das Modell eingebaut werden
• Nicht-Additivität von soften Interaktionen
• ? z.B. elektostatische Abstoßung
• Modell gibt keine realistische Beschreibung
  der Interaktionen

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Grenzen des Modells und mögliche Verbesserungen
(II)

• Einfluss von strukturellen Details
• ? brauchbare Schätzungen von excluded volume
  benötigen eine gute Auflösung von Größe und Form
  der interagierenden Partikel

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Wie beobachtet man makromolekulare Reaktionen in
crowded media? (I)

• Fluoreszenzbasierte Methoden
• ? messen die Abnahme der brownschen Bewegung
  eines fluoreszenzmarkierten Protein, wenn es mit
  anderen Proteinen assoziiert
• FRET (Fluorescence resonace energy transfer)
• ?spürt durch crowding eingeleitete
  Konformations-änderungen auf
• FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)
• ?misst die Verteilungsbewegung von
  fluoreszenzmarkierten Molekülen

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Wie beobachtet man makromolekulare Reaktionen in
crowded media? (II)

• NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
• ? Charakterisieren makromolekulare Bewegungen und
  Konformationen in crowded media in lebenden
  Zellen
• Cryoelektronenmikroskopie
• ?Sichtbarmachen des Zellinneren und Aufspüren von
  komplexen makromolekularen Zusammenlagerungen

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Effekte von Crowding auf Proteinfaltung an einem
Beispiel

• A. Elcock (Iowa,USA) simulierte die Flucht von
  einem Rhodanese-Molekül aus dem GroEL-Käfig
  (Chaperon)
• Experimentelle Durchführung von Martin und Hartl
  (Tübingen)
• ? hohe crowder Konzentration zwingt die
  Faltungszyklen in dem gleichen GroEL-Käfig
  abzulaufen

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GroEL/GroES Aufbau

• 2 heptamere Ringe die einen Zylinder bilden
  (GroEL)
• Heptamere Kappe die sich anlagert und den
  Innenraum vergrößert (GroES)

Lewin, Molekularbiologie der Gene
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GroEl/GroES Mechanismus

• Schrittweiser Prozess
• Mit jedem Schritt geht ATP-Hydrolyse einher
• GroES für Freisetzung des Proteins
• Protein wird nach jedem Faltungszyklus
  freigesetzt und wieder eingefangen

Lewin, Molekularbiologie der Gene
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Methoden

• Brownsche Dynamiksimulation
• Das Profil der freien Energie wird berechnet,
  wenn ein Rhodanese-Molekül aus dem GroEL-Käfig in
  Umgebungen mit verschiedenen Crowder-Konzentration
  en entlassen wird

Rhodanesestruktur aus PDB
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Methoden bezüglich der Molekülstrukturen

• GroES aus den Simulationen ausgelassen
• Rhodanese-Struktur Kristallstruktur des komplett
  gefalteten Proteins, weil die Simulationsmethode
  keine interne Flexibilität abdeckt
• ? Ergebnisse werden höchstens unterschätzt
• Keine detaillierte Struktur für den crowder
  Ficoll 70
• ?modelliert als kugelförmiges Molekül
  (Radius 30Å), alle Moleküle sind gleich

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Methoden

• Interaktionen zwischen den Oberflächenatomen von
  Ficoll 70, GroEL und Rhodanese werden durch das
  Lennard-Jones-Potential modelliert
• Jedes hinzugefügte crowder-Molekül wird zunächst
  an 10 zufällig gewählten Positionen platziert.
  Die Position mit der günstigsten Energie wird
  genommen
• Verteilungskoeffizienten abhängig vom
  Molekulargewicht wählen
• Bewegung der crowder simuliert durch den Ermak
  -McCammon - Algorithmus

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Berechnung von ?G

• Rhodanese wird in 0.5 Å Schritten von der
  Ausgangsposition im Käfig zu der Endposition (150
  Å entfernt vom Käfigzentrum) bewegt
• Änderung der freien Energie berechnet durch
• ?E Differenz der Systemenergien, wenn sich
  Rhodanese an den Positionen x und x0.5 Å befindet

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Ergebnisse (I)

• Je größer die Konzentration an crowder-Molekülen,
  desto größer wird die zum Entfernen von Rhodanese
  benötigte Energie
• ?größere Konzentration an crowdern macht die
  Flucht von Rhodanese unwahrscheinlicher

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Ergebnisse (II)

• Je größer die Konzentration an crowdern desto
  größer ist der Betrag an komplett gefalteten
  Rhodanesemolekülen
• Experimentelle und berechnete Daten stimmen sehr
  gut überein

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Ergebnisse (III)

• Crowder durch Ladungs-patches modifiziert
• ? benötigte freie Energie erhöht sich
  beträchtlich, allerdings erst bei sehr hohen
  crowder-Konzentrationen
• ??G freie Energie bei Anwesenheit der crowder
  minus freie Energie bei Abwesenheit der crowder

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Analogie zum Hydrophoben Effekt

• Wenn crowder-Moleküle am liebsten miteinander
  interagieren
• ? Störungen der crowder-crowder Interaktionen
  werden begrenzt
• ?Dissoziation der gelösten Proteine wird
  verhindert

Eisberg Modell, Kauzberg 1959
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Ausblicke

• Makromoleküle die die günstigsten
  Wechselwirkungen mit sich selbst eingehen als
  effektive crowder, die schwache
  Protein-Protein-WW stabilisieren
• ? muss über excluded volume effect hinaus gehen

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Zusammenfassung der Effekte von Crowding

• Vergrößert die Reaktivität von Makromolekülen
• Proteinfaltung wird unterstützt
• Beeinflusst biochemische, biophysische und
  physiologische Prozesse
• Bsp. ? Nukleinsäure und Proteinkonformation
  
• ? Protein-Protein- und
  Protein-DNA-
• Assoziationsgleichgewichte und
  Kinetik
• ? katalytische Aktivität von
  Enzymen
• ? Regulation des
  Zellvolumens

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Referenzen

• Rivas, G., Ferrone, F., and Herzfeld, J., (2004)
  EMBO Reports, 5, 23-27. Life in an Crowded World
  Workshop on the Biological Implications of
  Macromolecular Crowding.
• Hall, D. and Minton, A.P., (2003), Biochim.
  Biophys. Acta, 1649, 127-139. Macromolecular
  Crowding Qualitative and Semi-Quantitative
  Successes, Quantitative Challenges.
• Elcock, A.H., (2003) Pro. Natl. Acad. Sci. USA,
  100, 2340-2344. Atomic-Level Observation of
  Macromolecular Crowding Effects Escape of a
  Protein from the GroEL Cage.