BIOLOGIA MOLECULAR

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BIOLOGIA MOLECULAR
Tecnologia do DNA recombinante
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Conteúdo

• DNA recombinante
• Enzimas de restrição
• Vetores de clonagem
• - Plasmídios
• - Bacteriófagos
• - Cosmídeos
• 4. Etapas de clonagem molecular
• 5. Aplicações

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HISTÓRICO
Tecnologia DNA recombinante Insulina
recombinante (1978)
Ian Wilmut clonagem de mamífero (1997)
Watson Crick Estrutura do química do DNA
(1953)
Nature, 25 - Abr - 1953
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HISTÓRICO
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O que é um DNA recombinante?

• - É uma molécula de DNA formada pela ligação de
  duas moléculas de origens diferentes (Ex. DNA de
  planta ligado a um plasmídio)

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• A engenharia genética atua no nível molecular,
  onde as diferenças entre espécies desaparecem

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(No Transcript)
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Descritas em 1970,

• Uma enzima de restrição ou endonuclease de
  restrição é um tipo de nuclease que cliva fita
  dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência
  particular de nucleotídios que seja o sítio de
  restrição da enzima

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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Função Natural proteger o DNA bacteriano do DNA
exógeno
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

• A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita

BamHI
- reconhecem seqüências específicas de
nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras
tesouras moleculares
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Nomenclatura

• BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H
• 5 G/GATCC 3
• EcoRI - Escherichia coli R
• 5 G/AATTC 3
• HaeIII - Haemophilus aegyptius
• 5 GG/CC 3
• PstI - Providencia stuartii
• 5 CTGCA/G 3

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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
EcoRI
370 C, 1 hora, com tampão adequado
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Tipos de cortes - Produção de terminais
coesivos (adesivos, protuberantes) - Produção de
terminais abruptos (ou cegos)
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ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

NarI

181 ACCATATGCG GTGTGAAATA
CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC
TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC
TTTTATGGCG TAGTCCGCGG 241 ATTCGCCATT
CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC
TCTTCGCTAT TAAGCGGTAA GTCCGACGCG
TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA
301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT
AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT ATGCGGTCGA
CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT
TGCGGTCCCA
HindIII PstI

361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT
AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG
AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT
CGAACGTACG GACGTCCAGC XbaI BamHI
KpnI EcoRI

421
ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT
CATGGTCATA GCTGTTTCCT TGAGATCTCC
TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT
CGACAAAGGA
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TIPOS DE VETORES
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TIPOS DE VETORES
Vetores
Hospedeiros
Utilização
clonagem
Plasmídeos
Bactérias / leveduras
Cosmídeos
Bacteriófagos
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VETORES PLASMIDIAIS

• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita
  dupla, extracromossomais, que ocorrem
  naturalmente em bactérias e algumas leveduras
• pUC18
• pBR322
• pUP310
• Ob. Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb

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VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expressão em Procarioto
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VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expressão em Eucariotos
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Vacina Vetorizada (rBCG)
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VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expressão em Eucariotos
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BACTERIÓFAGO

• Vírus que infectam bactérias
• Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

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BACTERIÓFAGO
Ciclo Lisogênico
Ciclo Lítico
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COSMÍDEOS

• São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos
• - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35
  kb

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Características essenciais
VETORES DE CLONAGEM

• Replicação autônoma
• Marcador de seleção (antibiótico)
• Sítio único de clonagem

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VETORES DE EXPRESSÃO

• Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de
  ATG
• Promotores induzíveis
• Sinais de secreção
• Fusão com proteínas carreadoras

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CLONAGEM MOLECULAR
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CLONAGEM MOLECULAR

• É o isolamento e a propagação em um organismo de
  moléculas idênticas de DNA

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CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

• 1. Obtenção do DNA a ser clonado
• 2. Preparação do vetor
• 3. Ligação do vetor com o inserto
• 4. Transformação da bactéria
• 5. Seleção dos clones recombinantes

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1.Obtenção do DNA a ser clonado

• Extração de DNA
• PCR
• Digestão
• Purificação

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1.Obtenção do DNA a ser clonado
PCR
94 0C por 5 min 94 0C por 1 min 55 0C por 1
min 72 0C por 1 min 72 0C por 5 min 4 0C
35 ciclos
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Eletroforese em gel de agarose
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Visualização do DNA em luz ultravioleta
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3.Preparação do vetor

• Digestão
• Purificação

Plasmídeo linear
Plasmídeo Circular
Digestão com Enzimas de restrição
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4. Ligação
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5.Transformação da bactéria
CHOQUE TÉRMICO
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5.Transformação da bactéria
ELETROPORAÇÃO
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5.Transformação da bactéria
ELETROPORAÇÃO
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6.Seleção dos clones recombinantes
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Construção do DNA Recombinante
Molécula de DNA de um plasmídeo linear com
extremidades coesivas
Molécula de DNA de um plasmídeo circular
anelamento
Clivagem com enzima de restrição
Ligação covalente pela DNA ligase
Inserção em uma célula hospedeira
Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto
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Extração de DNA de L. interrogans
Leptospira interrogans
meio EMJH
Extração de DNA
PCR
94ºC 5 min 94ºC 1 min 50ºC 1 min 72ºC 1
min 72ºC 7 min
30 ciclos
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Construção dos Vetores
Clonagem em Vetores de expressão
PCR
 
Transformação E. coli
Seleção dos Clones recombinantes
lipL32 768 pb
Digestão
Extração
Triagem
768 pb
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Expressão de Proteínas Recombinantes
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Purificação de proteínas recombinantes
Ligação
Transformação por Eletroporação
Extração de DNA plasmidial
E. Coli DH5?
pLysS
codon pluss
Transformação por Choque Térmico
SI
DE3
E. coli (BL21)
Cepas de E. coli para expressão de proteínas
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SDS-PAGE
SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas)
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Expressão de Proteínas Recombinantes
Expressão em diferentes cepas de E.coli
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Purificação de Proteínas Recombinantes
Akta Prime
Gel de poliacrilamida 15.

• BENCHMARKTM Protein Ladder em kDa
• 2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições).

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APLICAÇÕES
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VACINAS RECOMBINANTES
1. PCR
2. Clonagens
3. Multiplicação
4. Vacinação
Proteína Recombinante
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ANIMAIS TRANSGÊNICOS
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PLANTAS TRANSGÊNICAS