Pr

1
Etude de la régulation dans le système
immunitaire associé à lintestin à travers
létude de la tolérance orale et des colites
inflammatoires expérimentales
2
150 g/24H protéines
Pathogènes
1014 bactéries commensales
300 m2
Réponse immune proinflammatoire
Réponse immune contrôlée /tolérance
Protection LOCALE
Protection SYSTEMIQUE
HOMEOSTASIE
3
Immunité adaptative
Immunité innée
1012 cellules lymphoïdes /m intestin
Macrophages Polynucléaires
barrière épithéliale mucus secrétions
digestives péristaltisme
Cellules dendritiques
HOMEOSTASIE
4
Système lymphoide associé à lintestin
site effecteur plasmocytes IgA T cells matures
site inductif tissu lymphoïde organisé
plaques de Peyer
Ganglion mésentérique
sang
Bone
Canal thoracique
5
150 g/24H protéines
Pathogènes
1014 bactéries commensales
300 m2
Réponse immune proinflammatoire
Réponse immune contrôlée /tolérance
Protection LOCALE
Protection SYSTEMIQUE
HOMEOSTASIE
6
Différentes voies dabsorption des protéines
Lumière intestinale
1. Plaques de Peyer Cellules M
Digestion des protéines totale ou partielle
Entérocytes (transcytose,
exosomes?)
2.
3. Cellules dendritiques ?
7
Chez la souris, 1 heure après administration
orale dOVA, les cellules dendritiques du
chorion et des plaques de Peyer sont chargées en
peptides immunogènes et peuvent stimuler in vitro
la prolifération de LT TCR-OVA
T anti-OVA CD4 DO11.10
Chirdo et al Eur J Immunol 2005 351831
8
2. Entérocytes
Chambres dUssing
Intest.
Antigène radiomarqué 3H
M
S
Duodenum humain b-lactoglobuline/HRP
R (Ohms/cm2) PD / Isc
PD mV
Isc
M
3H-peptide
radio-HPLC
9
Voies dendocytose des antigènes luminaux
TJs
Ag
Intacte lt10
Voie directe
IEC
Peptides 40
Voie lysosomale
Acides aminés 50
flux total 3 µg/h.cm²
? 0.3 µg/h.cm² ag intact
Les antigènes sont captés au niveau de la
membrane apicale par endocytose non spécifique
et partiellement dégradés dans lentérocyte
(endosomes-lysosome) avant dêtre libérés au pôle
basal de la cellule. Pas de diffusion
paracellulaire en condition physiologique
10
Rôle des exosomes épithéliaux dans linformation
du SI intestinal
11
Pathologies digestives et entrée dantigènes
médiée par récepteur
Exemple de lallergie rôle de CD23 dans
labsorption de protéines alimentaires
(allergènes)
Expression anormale CD23 (FceRII)
S
.
.
.
.
.
.
Cl-
.
Lysosomal degradation
.
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.
(Perdue M et al)
.
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.
.
.
.
.
.
.
.
S
S
.
Médiateurs
degradation gt97
Transport  protégé  dallergène intact
Activation des mastocytes
12
Entrée dantigènes médiée par récepteurs /-
pathologies digestives
R. Blumberg
M Heyman
B. Corthésy
Plaques de Peyer
enterocytes
enterocytes
S
antigène
sIgA
sIgA
IgG
Récepteur ?
.
.
.
.
FcRn
.
.
Activation CD des PP Rôle physiologique?
.
Lysosomal degradation
.
Rôle physiologique ?
.
.
.
.
.
.
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.
.
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.
.
.
.
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.
.
.
.
.
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.
.
.
S
S
.
dégradation gt97
Transport  protégé  dantigène intact Captation
par les CD?
Captation par les CD?
13
Chez la souris, 1 heure après administration
orale dOVA, les cellules dendritiques du
chorion et des plaques de Peyer sont chargées en
peptides immunogènes et peuvent stimuler in vitro
la prolifération de LT TCR-OVA
T anti-OVA CD4 DO11.10
Chirdo et al Eur J Immunol 2005 351831
14
Les antigènes protéiques peuvent être captés par
différents mécanismes par les CD intestinales du
chorion Et des plaques de Peyer En situation
normale, sétablit une tolérance immunitaire
active
15
TOLERANCE ORALE Historique
1990 - Induction de tolérance dans des modèles
expérimentaux de maladies autoimmunes et de
rejet de greffe - Applications thérapeutiques
(H. Weiner) ????
16
TOLERANCE ORALE DEFINITION ?
Tolérance systémique
Inhibition des réponses T et Ben périphérie
Allergies 2-7 nourrissons 2 adultes
Ag po
Ag par voie systémique
Tolérance locale ??
Inhibition des réponses T intramuqueuses
proinflammatoires
Maladie coeliaque 1/100 -1/300
17
Tolérance orale
(Weiner HL, 2005 Immunol Rev)
Administration orale dantigènes
GALT
Faible dose (0,5-5 mg)
Forte dose (50 mg)
Déviation immune TH1 vs TH2 ?
Induction de cellules T régulatrices Th3 (TGF?),
Tr1 (IL10), Treg ?(CD25 CTLA4 FoxP3) LT CD8
(TGF?, )?, LIE T?? ??
Délétion (apoptose) Anergie Th1 gt Th2
 SUPPRESSION  TRANSFERABLE
ANERGIE/DELETION CLONALE
18
MISE EN EVIDENCE EXPERIMENTALE DE LT
REGULATEURS DANS LA TOLERANCE ORALE SYSTEMIQUE
TT intrapéritonéal MBP CFA
TT oral
Encéphalomyélite autoimmune
O

Ag contrôle
MBP 0,5mg po X5
Lymphocytes T régulateurs CD4 (ou CD8)
19
NATURE DES LT REGULATEURS AU COURS DE LA
TOLERANCE ORALE
TT intrapéritonéal MBP CFA
EAE
TH1
?IFN, TNF

MBP po 0,5mg X5
TH2
IL4/IL10
TGF?
IL4 / IL10
TH3
Chen et al Science 1994
20
 EFFET PROTECTEUR BYSTANDER 
TT intrapéritonéal
EAE
MBP CFA
MBP po 0,5mg X5
TGF?
IL4/IL10
TH3
PLP CFA
TGF?
IL4/IL10
Chen et al Science 1994
21
Treg  naturelles 
Treg CD4 CD25 CTLA4 FoxP3 anergiques
Treg  induites 
Contrôle des réponses autoimmunes et des réponses
immunes souris/homme
22
Zhang et al J. Immunol. 2001 167 4245
souris Tg OVA TCR
20mg/ml OVA
LT CD4CD25 anti-OVA
Transfert in vivo
OVA 20mg /jour 14
In vitro Ne répondent pas à OVA
(anergiques) Inhibent réponse des CD4 CD25- à
OVA Ont un effet inhibiteur bystander (BSA)
Souris BalbC
OVA100 ug-CFA Jour1
Inhibent DTH
23
souris Tg OVA TCR
PBS
Anti-CD3
20mg/ml OVA
IL10 TGFb
24
Tolérance systémique versus tolérance locale ??
25
PRODUCTION IN SITU DE CYTOKINES 6 À 48H APRES
ADMINISTRATION ORALE DOVALBUMINE CHEZ UNE SOURIS
TRANSGENIQUE TCR-ANTI-OVA
FOXP3 ???
Gonella et al J. Immunol. 1999 160 4708
26
REGULATION INTRAMUQUEUSE
HEL per os
Inhibiteur de Cox2
Souris transgéniques portant un récepteur T
anti-HEL
PGE2 dans le chorion intestinal
IL10
Intestin normal
IL12, TNF
Prolifération T Atrophie villositaire
Newberry RD et al Nature Medicine 1999 8900
27
Maladie coeliaque entéropathie induite par un
antigène alimentaire
Facteurs environnementaux gluten prolamines des
céréales (blé, orge et seigle)
inflammation
Atrophie villositaire
Facteurs génétiques HLA-DQ2 ou DQ8
Transformation maligne
28
Induction de la tolérance orale Site(s) ??
Mécanisme?
29
Système lymphoide associé à lintestin
site effecteur plasmocytes IgA T cells matures
site inductif tissu lymphoïde organisé
plaques de Peyer
Ganglion mésentérique
sang
Bone
Canal thoracique
30
Suivi in vivo de la réponse à lOVA
Souris BALB/C
gavage OVA
24 h
LT CD4naïfs TCR anti-OVA DO11.10
24 h, 48 h 72h
I.V
marqués au CFSE
MLN PP rate
Caractérisation phénotypique et fonctionelle des
cellules portant le TCR anti-OVA (AC anti-TCR)
F Hauet-Broere et al Eur J Immunol 2003, 33
2801-10
31
Cinétique et localisation de la prolifération des
LT CD4 OVA spécifiques in vivo
CONCLUSION Prolifération des LT OVA spécifiques
dans les PP précède celle des MLN
32
Caractérisation phénotypique des LT spécifiques
de lOVA lors de linduction de la tolérance
orale
MLN
CD 69 marqueur dactivation précoce
CD 44 marqueur dactivation
33
Caractérisation phénotypique des L.T spécifiques
de lOVA Lors de linduction de la tolérance
orale
MLN (idem pour PP, Rate)
?4?7 recrutement au niveau de la muq.
intestinale
Surexpression de ?4?7 dès la 1ère
division Surexpression de CTL4 à la 7ème division
(tardif)
34
Caractérisation phénotypique des L.T spécifiques
de lOVA Lors de linduction de la tolérance
orale
CD25 Hi
augmentation de lintensité de CD25 division in
vivo mais proportion reste 10 des
CD4 Stimulation de T reg naturelles?
35
Acquisition dune activité suppressive? Transfert
de tolérance
Gavage OVA/PBS
OVA/Adjuvant, s.c
Souris BALB/C
48 h
24 h
rate, G.M, PP
Souris Tg DO11.10 TCR OVA (LT activés par le
gavage)
I.V
LT CD4 DO11.10 KJ1-26 (5.104 à 5.105 C/ml ) 80
pureté
Rappel OVA
Mesure de lœdème auriculaire, DTH
36
3.Acquisition dune activité suppressive?
Tolérance orale induite chez les souris ayant
reçu les KJ1-26 dun donneur recevant de lOVA.
Les cellules suppressives sont détectées dans les
MLN et PP HypExistence dune fraction de LT CD4
spécifiques devenus des cellules Treg?
37
3.Acquisition dune activité suppressive?
MLN Pool de LT CD4
FACs Isolement de LT OVA KJ1-26 se ? CD25 et
CD25-
Induction de tolérance orale par les LT OVA
KJ1-26 CD25 et CD25-
38
Caractérisation phénotypique des L.T spécifiques
de lOVA Lors de linduction de la tolérance
orale
gavage OVA/ BSA 5 jours
Souris SCID DO11.10 (LT CD4 portant
exclusivement un TCR anti-OVA et donc ne
contenant pas de LT reg FoxP3 à létat
naïf) Permet de démontrer linduction de
cellules T reg  induites  par lantigène dans
les gg mésentériques
Coombes, J. L. et al. J. Exp. Med.
20072041757-1764
39
Les LT régulateurs CD4CD25 FoxP3
Treg naturelles
Treg induites
Contrôle réponses ag exogènes
Modified from Sakaguchi, 2003
Autoimmunité, allergies alimentaires
40
Induction de la tolérance orale Site(s) ??
Mécanisme? Rôle des cellules dendritiques
intestinales
41
1 heure après administration orale dOVA, les
cellules dendritiques du chorion et des plaques
de Peyer sont chargées en peptides immunogènes et
peuvent stimuler in vitro la prolifération de LT
TCR-OVA
T anti-OVA CD4 DO11.10
Chirdo et al Eur J Immunol 2005 351831
42
Effet tolérogène des CD isolées du chorion
Mesure DTH, IFN?
Gavage OVA
J10 10µgOVA/CFA coussinet plantaire opposé J21
100µg OVA agrégée
Isolement CD à 1H Inj coussinet plantaire
Chirdo et al Eur J Immunol 2005 351831
43
Induction tolérance orale rôle des CD
intestinales Venant du chorion ou des PP et
migrant dans les GG Mésentériques
plaques de Peyer ??? (ablation PP, souris sans PP)
Contrôle réponses locales
Phase effectrice
Inhibition réponses périphériques
Ganglion Mésentérique Migration CD
(CD103?tolérogènes?)
sang
Bone
Canal thoracique
44
Oral tolerance originates in the intestinal
immune system and relies on antigen carriage by
dendritic cells (in MLN)
Blocage migration lymphos pas deffet Sur
linduction de la tolérance orale
Ablation G. mésentériques blocage tolérance
orale
T. Worbs et al. J. Exp. Med 2006, 203519
45
Chez souris CCR7-/- ou CCR7ligands-/- absence de
tolérance orale corrélée avec rétention des CD
CD11c CD103 dans le chorion
Transfer 107 CFSE-labeled OTII cells
Gavage 100 mg J1
Pas de prolifération LT CD4 OVA dans GM des
CCR7(L)-/-
chez CCR7-/- Rétention des CD CD11c CD103 dans
la LP Pas de migration dans Gmes
Pas de suppression DTH chez CCR7-/-
T. Worbs et al. J. Exp. Med 2006 203519
46
Induction tolérance orale conversion
préférentielle des LT CD4 en LT CD4 reg FoxP3
dans le GALT par les CD intestinales
plaques de Peyer
Contrôle réponses locales
Phase effectrice
(Inhibition réponses périphériques)
Ganglion Mésentérique Induction par les CD
CD103gtgt CD103- de LT CD4 FoxP3 reg
sang
Y. Belkaid et al RJ Noelle et al F Powrie et al
J. Exp. Med 07/2007 SG Kang et al JI
2007 Cheroutre et al Science 07/2007

Bone
47
induction de LT reg spécifiques de lOVA par les
CD intestinales CD103
in vitro LT de SCID DO11.10 (CD4 TCR antiOVA)
CD CD103/CD103- OVA (0.2µg/ml)
CD103 parmi les CD CD11c high
Induction de LT FoxP3 (anti-OVA) Par les CD 103
Coombes, J. L. et al. J. Exp. Med.
20072041757-1764
48
Linduction de LT reg spécifiques de lOVA par
les CD intestinales CD103 dépend en partie de
leur production de TGFbeta (chez la souris)
Induction in vitro LTFoxP3 par CD CD103
OVA Bloquée par AC antiTGFb
CD CD103 produisent plus TGFb
latent activateur plasminogène (activateur
TGFbeta)
Addition TGF-b exogène Augmente leffet
inducteur des CD CD103 mais peu leffet des CD
CD103-
Coombes, J. L. et al. J. Exp. Med.
20072041757-1764
49
LT matures effecteurs
Plasmocytes IgA
TECK/CCL25
Plaques de Peyer
Endothélium
Blastes IgA
Blastes T
MadCAM1
Canal thoracique
Ganglions mésentériques
intégrine ?4?7/ CCR9
Récepteurs Homing Intestinal
PP-DC MLN-DC CD103 (intégrine ?E)
Ac. Rétinoique
50
Linduction de LT reg spécifiques de lOVA par
les CD intestinales CD103 dépend de leur
production dacide rétinoïque
Lacide rétinoique (TGFb) permet aux CD
CD103- dinduire les T reg FoxP3 Transforme des
CD spléniques Chez lhomme lacide rétinoique
semble induire les LT reg FoxP3 En labsence de
TGFb
Les CD CD103 expriment lenzyme qui transforme
la vitA en acide rétinoïque
Coombes, J. L. et al. J. Exp. Med.
20072041757-1764
51
Induction tolérance orale conversion
préférentielle des LT CD4 en LT CD4 reg FoxP3
dans le GALT par les CD intestinales
plaques de Peyer
Contrôle réponses locales
Phase effectrice
(Inhibition réponses périphériques)
Ganglion Mésentérique Induction par les CD
CD103gtgt CD103- De LT CD4 FoxP3 reg avec
récepteurs de homing intestinal Acide rétinoïque
et TGFbeta (souris)
sang
Y. Belkaid et al RJ Noelle et al F Powrie et al
J. Exp. Med 07/2007 SG Kang et al JI
2007 Cheroutre et al Science 07/2007

Bone
52
En situation basale, les entérocytes
conditionnent les CD résidentes en CD
tolérogènes (CD103)
Iliev, I. D. et al. J. Exp. Med.
20072042253-2257
Vitamine A Acide rétinoïque?
B.Commensales? Flore et allergie alimentaire?
53
Role proinflammatoire des CD CD103-
CD CD103-produisent plus de cytokines
proinflammatoires que les CD CD103 en
réponse aux  signaux dangers 
IL-23
CD CD103-expriment plus Les TLR et T-bet
T-bet
54
Importance des LT FoxP3 dans la tolérance
orale Chez lhomme? -IPEX allergies
alimentaires -Maladie coeliaque ???
55
Maladie coeliaque entéropathie induite par un
antigène alimentaire
Facteurs environnementaux gluten prolamines des
céréales (blé, orge et seigle)
inflammation
Atrophie villositaire
Facteurs génétiques HLA-DQ2 ou DQ8
Transformation maligne
56
Adaptive response
Innate response
gliadin
peptide 31-49
IL-15
33 mer
IEL
?
MHC Ia
MHC Ib
NKR
?
LT reg FoxP3
APC
APC
IFN-g
DQ2/8
IL-15
CD4 effector Tcell
TGF-? (Smad3)
BenAhmed et al Gastroenterology 2007
57
150 g/24H protéines
Pathogènes
1014 bactéries commensales
300 m2
Réponse immune contrôlée /tolérance
Réponse immune proinflammatoire
Protection LOCALE
Protection SYSTEMIQUE
HOMEOSTASIE
58
Les bactéries commensales peuvent entrer dans le
système immunitaireassociées à lintestin
Reinecker Science 2005
Rescigno NatImmunol 2001
McPherson Science 2004
59
MacPherson Science 2004
1- Elimination rapide des bactéries commensales
par les cellules phagocytaires de lhôte dans
les PP et GMes
2- Initiation de la réponse immune adaptative
60
Immunité adaptative et Homéostasie intestinale
LymphocytesT
IgA
1- LT proinflammatoires TH1gtTH2 TH17
61
La colonisation bactérienne induit simultanément
dans liléon
62
(No Transcript)
63
MODELES EXPERIMENTAUX DE COLITES INFLAMMATOIRES
Altérations de la barrière épithéliale
Inactivation E-cadhérine /kératine-8/Mdr-1 Intesti
nal trefoil peptide destruction chimique
épithélium DSS
Modifications du système immunitaire
Stimulation excessive des LT effecteurs
stat4tg/TNFARE/G?i2-/-/IL7Tg/.. Injection
IR TNBS/ Oxazolone
Défaut de régulation KO IL2/IL2R??, IL10, TGF?
Absence de LT régulateurs (IPEX, modèles murins)
Modèles spontanés C3H/HeJBIR mice
64
COLITES INFLAMMATOIRES EXPERIMENTALES MODELES
DE REGULATION DE LA REPONSE IMMUNE INTESTINALE A
LA FLORE INTESTINALE
déclenchées par la présence d une flore
intestinale et/ou associées à une rupture de la
tolérance vis-à-vis de la flore
Lymphocytes T pathogènes proinflammatoires
TH1gtTH2/TH17 TH1 dirigés contre la flore caecale
Activation dune cascade de signalisation Impliqua
nt en particulier la voie NFkB
Lymphocytes régulateurs protecteurs
65
LT CD4 CD45RB high LT CD4 CD45RB low
LT CD4 CD45RB high
i.v.
i.v.
Souris SCID
Souris SCID/ H
PAS DE COLITE LT régulateurs CD25
CTLA4FoxP3 présents dans les Gg mes
(LP?) Effets bloqués par Anti-TGF?,anti-CTLA4
Médiés par T reg TGF-? -/- Si T effectrices
répondent au TGF ?
COLITE LT délétères (TH1, TH17?) TH1
spécifiques de la flore cytokines délétères IFN,
TNF, IL17?
daprès F. Powrie
66
LT CD4 CD45RB low
Souris 129VEv/Rag-/-
Infection orale H Hepaticus
Souris SCID
PAS DE COLITE LT régulateurs CD25 CTLA4
(FoxP3??) migrant dans lintestin Spécificité ? T
reg naturelles
COLITE par ACTVATION IMMUNITE INNEE IL-23 gtgtgt
IL-12 Relais IL-17
daprès F. Powrie
67
Induction de la tolérance aux bactéries Site(s)
?? Mécanisme? Rôle des cellules dendritiques
intestinales
68
Induction tolérance flore conversion de LT CD4
en LT CD4 reg FoxP3 dans le GALT par les CD
intestinales
plaques de Peyer
Inhibition des réponses inflammatoires
intramuqueuses à la flore
sang
Ganglion Mésentérique Induction par les CD
CD103gtgt CD103- De LT CD4 FoxP3 reg Et
inhibition de la génération de TH17 Acide
rétinoïque et TGFbeta
Bone

Cheroutre et al Science 07/2007
69
CD CD103-produisent plus de cytokines
proinflammatoires que les CD CD103 en
réponse aux  signaux dangers 
IL-23
CD CD103-expriment plus Les TLR et T-bet
T-bet
70
INDUCTION RECIPROQUE DE LA DIFFERENCIATION TH17
et Treg PAR LACIDE RETINOIQUE
LT anti-OVA OVA MLN DC IL17/- induit par
inhibiteur Ac rétinoique Spleen DC IL17
bloqué par Ac rétinoique
71
INDUCTION RECIPROQUE DE LA DIFFERENCIATION TH17
et Treg PAR LACIDE RETINOIQUE
LT anti-OVA OVA MLN DC FoxP3
(a4ß7CCR9) bloqué par inhibiteur Ac rétinoique
Spleen DC FoxP3 0 induit par Ac rétinoique
72
TGFb et RA sont capables in vitro de transformer
des LT CD4 en LT régulateurs (en présence
danti-CD3) qui peuvent inhiber la colite induite
par les CD45RB high non traitées
Colite
Colite 0
T CD4 antiCD3 FoxP3
IL-17
Stimulation primaire cytokines 2 jours de repos
IL2 Restimulation par anti-CD3
73
En situation basale, les entérocytes
conditionnent les CD résidentes en CD
tolérogènes (CD103)
Iliev, I. D. et al. J. Exp. Med.
20072042253-2257
Vitamine A Acide rétinoïque?
B.Commensales? Flore et allergie alimentaire?
74
Immunité adaptative et Homéostasie intestinale
IL-12,23IL-15 IL-1,IL-6 TLR, NOD?
Signaux dangers /Récepteurs Immunité innée
TGF?, AR
TGF? IL10
1- LT proinflammatoires TH1gtTH2 TH17
2-LT régulateurs CD4FoxP3 TGF?/IL-10
75
Rôle de LT régulateurs dans les maladies
inflammatoires chez lhomme Syndrome IPEX
anomalie primitive des Treg (inflammation Grêlegt
colon Allergies alimentaires) Crohn et RCH
pas danomalie primitive documentée Anomalie de
la barrière épithéliale probable dans
Crohn Anomalie de régulation des Macrophages
/DC???
76
150 g/24H protéines
Pathogènes
1014 bactéries commensales
300 m2
Réponse immune contrôlée /tolérance
Réponse immune proinflammatoire
Protection LOCALE
Protection SYSTEMIQUE
HOMEOSTASIE
77
(No Transcript)
78
Qq hypothèses dans la M. de Crohn selon W. Strober
gènes autophagie
79
LT CD4 IL10-/- LT CD4 CD45RB low venant dune
souris infectée par HH
LT CD4 de souris IL-10-/- Infectées par H.
Hepaticus
i.v.
i.v.
Souris Rag B6
Souris RAG.B6
PAS DE COLITE LT régulateurs CD25 ou
CD25- Spécifiques de HH, synthétisant de lIL-10
Effets nécessitent IL-10 Pas TGFbeta
0 pas de colite
HH COLITE Production IFN Rôle IL17/IL23
daprès MC Kullberg