LA C

1
LA CÉLULA COMO UNIDAD VITAL
2
LA CITOLOGÍA

• En el siglo XVII aparece la Citología como
  ciencia debido a
• Aparición de Bacon, Descartes... lo que era una
  ciencia especulativa pasó a basarse en la
  experiencia y la observación.
• Avances tecnológicos uso de lentes para
  aumentar el tamaño de las cosas.
• Curiosidad científica.

3
LA INTERDISCIPLINARIDAD, LA COOPERACIÓN Y LA
CURIOSISDAD CIENTÍFICA HAN SIDO Y SON LA CLAVE DE
LA MAYORÍA DE LOS AVANCES CIENTÍFICOS
4
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA

• De qué están compuestos los seres vivos?
• Hasta el siglo XV se consideraba, tomando como
  base las ideas de Hipócrates (600 a.c.), que los
  seres vivos estaban formados por una sustancia o
  crasis a base de diferentes jugos o humores

5
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA

• EL MICROSCOPIO
• Se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los
  italianos, o por Jansen, en opinión de los
  holandeses

6
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA
ROBERT HOOKE
7
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA
LEEUWENHOEK POPULARIZÓ EL USO DEL MICROSCOPIO
(1964)
8
(No Transcript)
9
(No Transcript)
10
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA DESARROLLO DE
LA MIROSCOPÍA
11
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA LA TEORÍA
CELULAR

• Schleiden y Schwan son considerados los autores
  iniciales de la Teoría Celular, complementada
  luego por Virchow (omnis cellula e cellula) y
  universalizada a todos los tejidos por Ramón y
  Cajal (Premio Nobel en 1906).
• La Teoría Celular se puede resumir
• Existen seres unicelulares y pluricelulares
  todos los organismos son células o están formados
  por ellas.
• La célula es la unidad estructural, fisiológica y
  reproductiva de los seres vivos ? Es la unidad de
  vida independiente más elemental.

Ramón y Cajal
Rodolfo Virchow
12
COMPONENTES COMUNES EN LA MAYORÍA DE CÉLULAS

• MEMBRANA PLASMÁTICA
• CITOPLASMA
• INFORMACIÓN GENÉTICA

QUIÉN SE SALE DE LA NORMA?
13
NIVELES DE ORGANIZACIÓN CELULAR
CÉLULAS EUCARIOTAS

• CÉLULA PROCARIOTA

Bacillus anthracis
Tejido Cartilaginoso
14
CÉLULAS PROCARIOTAS CÉLULAS EUCARIOTAS
ORIGEN 3500 ma aprox 1500 ma aprox
TAMAÑO Generalmente de 0,2µ a 10 µm Generalmente de 10µ a 100 µm
ORGANISMOS Archaeas y Bacterias Protoctistas, hongos, plantas y animales
E. NUCLEAR No Si
ADN 1 molec ADN bc circular sin histonas Cromosomas
TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN En compart. e incluso al t. Separadas espacial y temporalmente
NUCLEOLO No Si
RIBOSOMAS 70 S 80S
CITOESQUELETO NO SI
ORGÁNULOS Pocos o ninguno Numerosos, sistema de memb
MEMB. PLASMÁT. Sin esteroles Con esteroles
PARED CELULAR Si, con PG Solo en vegetales, de celulosa
ORGÁNULOS ENERGÉTICOS mesosomas Mitocondrias y cloroplastos
METABOLISMO De todos los tipos Generalmente aerobio
DIV. CELULAR Bipartición o gemación Mitosis y meiosis
15
CÉLULA PROCARIOTA
16
Organización Celular Procariota REINO MONERAS
DOMINIO ARQUEA
DOMINIO BACTERIA
Ferroplasma acidiphilum
17
CÉLULA EUCARIOTA
18
Organización Celular Eucariota DOMINIO EUCARYA
Reino Protoctista
Reino Vegetal
Paramecium sp
Klebsormidium sp
Xilema y floema de pino
Reino Animal
Reino Hongos
Saccharomyces cerevisiae
Scytalidium thermophilum
Epitelio Cúbico Simple humano
19
LOS TRES DOMINIOS DE WOESE (1990)

• El Sistema de los Tres Dominios, propuesto por
  Woese, es un modelo evolutivo de clasificación
  basado en las diferencias en las secuencias del
  ARNr 16S y ARNt de la célula, la estructura de
  los lípidos de la membrana, y la sensibilidad a
  los antibióticos.

20
I. EL ORIGEN DE LA VIDA
Cambios Geológicos Descargas eléctricas Bombardeo
de meteoritos Sin oxígeno

• Hace 4500 ma,
• en La Tierra...
• En 1922, Oparin propone compuestos orgánicos
  simples pudieron originarse a partir de una
  mezcla de moléculas orgánicas (Síntesis
  prebiótica).

21
II. EL ORIGEN DE LA VIDA

• En 1952 Stanley Miller (1952) Oparin tenía
  razón.

22
III. EL ORIGEN DE LA VIDA

• Una vez surgidos los primeros compuestos
  orgánicos, éstos pudieron combinarse entre sí
  hasta dar lugar a una molécula con capacidad de
  copiarse a sí misma, posiblemente ARN, y
  posteriormente aparecerían el ADN y las
  proteínas. Estas moléculas se rodearon de
  membrana y establecieron el control sobre su
  replicación Las primeras células vivas!

23
III. EL ORIGEN DE LA VIDA otras teorías
Cometas y condritas
las arqueobaterias
Panspermia ?
24
LOS PRIMEROS SERES VIVOS

• BACTERIAS ANAEROBIAS CON METABOLISMO FERMENTATIVO
• CIANOBACTERIAS
• ATMÓSFERA CON OXÍGENO
• Evidencia de vida
  más antigua de la que hay
  registro fósil en la Tierra
• PRIMERAS CÉLULAS CON RESPIRACIÓN AEROBIA

Estromatolito fósil. 3500ma
25
Origen de las células eucariotas Teoría
Endosimbiótica
LINN MARGULIS
26
Origen de las células eucariotas Teoría
Endosimbiótica
Actualmente la idea más aceptada es que 1.- El
núcleo se formó por invaginación de la membrana
plasmática y de ahí se originaron también los
orgánulos membranosos del sistema de
endomembranas. 2.- Mitocondrias y Cloroplastos
se originaron por endosimbiosis.
27
Origen de las células eucariotas Teoría
Endosimbiótica
CÉLULA HOSPEDADORA Una Archea que perdió la
pared. CÉLULAS SIMBIONTES Una bacteria
púrpura no sulfurosa MITOCONDRIA. Una
Cianobacteria CLOROPLASTO.
Plantas y algas
Animales, hongos y protozoos
28

EVIDENCIAS A FAVOR DE LA TEORIA ENDOSIMBIÓTICA

• Las mitocondrias tienen su propio ADN en una sola
  molécula continua, como las de las procariotas
• Muchas de las enzimas de las membranas celulares
  de las mitocondrias se encuentran también en las
  membranas de las bacterias.
• Las mitocondrias solo se forman por fisión
  binaria a partir de otras mitocondrias
• Varias especies de Cianobacterias viven dentro de
  otros organismos como plantas y hongos, lo que
  demuestra que esta asociación no es difícil de
  mantener

29
Pruebas en contra de la teoria ENDOSIMBIÓTICA
Las mitocondrias y los plastos contienen
intrones, una característica exclusiva del ADN
eucariótico. Por tanto debe de haber ocurrido
algún tipo de transferencia entre el ADN nuclear
y el ADN mitocondrial/cloroplástico.
30
ORIGEN DE LA CÉLULA EUCARIOTA Consideración
actual

• Actualmente se considera que la evolución pudo
  darse a través de dos vías
• La aparición de membrana nuclear, retículo
  endoplásmico, aparato de Golgi, vacuolas y
  lisosomas se explicaría mediante la Teoría
  autógena.
• La aparición de mitocondrias y cloroplastos se
  explicaría mediante la Teoría endosimbiótica.

31
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA
NECESIDAD DE CONOCER LA CÉLULA (Aplicaciones
farmacéuticas, médicas, industriales,
conocimiento...)

• Necesidad del desarrollo de técnicas que
  permitan observar su estructura, y aclarar su
  composición y arquitectura molecular.

32
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS CÉLULAS

• Básicamente se cuenta actualmente con cinco
  modalidades principales para abordar el estudio
  de las células, y frecuentemente suelen
  utilizarse en forma conjunta más de una de ellas
  
• 1 - Observación de la estructura de las células
  por medio de microscopios (In vivo o post
  mortem).
• 2 - Fraccionamiento de células y análisis de sus
  moléculas (citoquímica).3 - Aislamiento y
  cultivo de células.4 - Localización de moléculas
  biológicas por medio de isótopos radioactivos o
  anticuerpos marcados.            5 - Utilización
  de la tecnología del ADN recombinante.

33
1. Métodos de estudio de la morfología y
estructura celular

• El pequeño tamaño y la transparencia a la luz
  visible de la célula han propiciado el desarrollo
  de una gran variedad de técnicas, enfocadas a
  aumentar el poder resolutivo y el contraste.
• El estudio de la morfología de las células puede
  llevarse a cabo en dos condiciones
• Métodos de estudio in vivo.
• Métodos de estudio post-mortem.

34
1.1.Métodos de estudio in vivo.

• Estudian al organismo vivo. Consisten en una
  observación directa, ayudada por instrumentos
  ópticos más o menos complejos.
• El problema que presenta este tipo de estudios es
  que el contraste que presentan las estructuras
  biológicas puede ser mínimo y es necesario
  aumentarlo. Esto se consigue mediante colorantes
  intravitales o determinado tipo de microscopios
  (de campo oscuro, de contraste de fases...)

35

• Observación in vivo al microscopio óptico de
  una gota de agua de maceta. (protozoo)

36
Organismo unicelular ciliado (Vorticella sp).
Observación in vivo
37
1.2. Métodos de estudio post-mortem.

• Es un método que consiste en preservar la
  morfología y composición de las células tras su
  muerte con el fin de estudiar los detalles de la
  morfología celular. Los pasos que se siguen,
  antes de la observación al microscopio, son
• Fijación de células
• Los fijadores suelen actuar sobre las proteínas
  celulares precipitándolas. Este proceso permite
  detener los procesos vitales.
• La fijación se puede realizar mediante métodos
  físicos, como la congelación, o métodos químicos,
  como el tetraóxido de osmio, líquido de Bouin,
  aldehídos...
• Tras la fijación de las muestras se procede a la
  obtención de cortes finos (se utilizan los
  llamados microtomos, en el que se introduce la
  muestra previamente endurecida e incluida en una
  parafina o resinas epoxi, que es el método más
  usual).
• Tinción.
• La tinción nos permite crear contrastes
  artificiales para facilitar la observación
• Las tinciones son sustancias de naturaleza
  orgánica y aromática, y se reconocen 2 grandes
  grupos ácidos y básicos..

38
(No Transcript)
39
Microtomo
Ultramicrotomo
40
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN

• 1.3.1. Tinción general. Una de las tinciones más
  utilizada es la hematoxilina-eosina
• Los ácidos nucleicos y otros componentes ácidos
  de la célula tienen afinidad por los colorantes
  básicos. (hematoxilina)
• El citoplasma, de naturaleza básica, se tiñe con
  colorantes ácidos. (eosina)

41

• Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero
  obtenida a partir de una inclusión en parafina y
  teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos
  aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el
  citoplasma de color rosado (eosina).

42
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN

• 1.3.2. Técnicas específicas.
• Tinción de Feulgen específica para el ADN. Tiñe
  el núcleo de color morado)
• Tetraóxido de osmio o Sudán III para lípidos.
• Las proteínas se colorean de azul con nihidrina.
• La celulosa o el almidón con Lugol, etc.

43
(No Transcript)
44
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN

• 1.3.3. Tinción diferencial utilizan al menos dos
  colorantes distintos es el caso de la llamada
  tinción de gram que permite diferenciar bacterias
  gram (color azul) de bacterias gram (color
  rojo), en base a su pared celular.

45
Tinción de Gram
Gram
Gram -
46
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN

• 1.3.4. Las tinciones también pueden utilizarse
  para poner de manifiesto determinada actividad
  enzimática. Por ejemplo, la existencia de
  fosfatasa ácida, característica de los lisosomas,
  se puede observar mediante la técnica de Gomori.

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• TÉCNICA DE GOMORI
• Incubación del tejido con glicerofosfato de
  sodio.
• Se añade nitrato de plomo. (con el fósforo
  liberado por la fosfatasa ácida, forma fosfato de
  plomo, que precipita y es fácilmente
  identificable al m.e.)

Ganglio linfático de rata.
48
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN

• 1.3.5. Tinción con colorantes fluorescentes.
• Naranja de acridina, se tiñen específicamente el
  ADN y ARN.
• Tinción de Auramina, etc.

49
Mycobacterium (bacterias ácido alcohol
resistentes) Tinción de Auramina Consiste en
teñir con Auramina (Colorante fluorocrómico),
decolorar con ácido alcohol, contracolorear con
permanganato potásico, lavar con agua abundante y
dejar secar
50
1.4.TIPOS DE MICROSCOPIOS
51
(No Transcript)
52
1.4.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA
53
1.4.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA

• Las dos características más importantes de un
  microscopio son
• Amplificación aumento del objetivo x aumento del
  ocular
• Poder de resolución (distancia mínima para que
  dos puntos próximos se vean como puntos
  diferentes) , que depende de
• Longitud de onda de la luz incidente a menor
  longitud de onda, mejor resolución ( menor poder
  de resolución).
• Índice de refracción del medio que se encuentra
  entre la muestra y el objetivo. (aire)

54
1.4.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA

• CONCLUSIÓN
• El principal factor limitante es la longitud de
  onda de la luz visible, es imposible construir un
  microscopio con un poder de resolución inferior a
  0,2 micrómetros.
• Los objetivos de inmersión tienen un poder de
  resolución mayor, ya que utilizan una sustancia
  viscosa como el aceite (indice de refracción1,5)
  frente al aire (índice de refracción1).

55
1.4.1. TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

• 1.4.1.1. M. de Campo Claro para observar
  muestras in vivo.
• 1.4.1.2. M. de Campo Oscuro para observar
  microorganismos en él un disco opaco bloquea la
  luz, de forma que sólo la luz refractada por la
  muestra alcanza el objetivo y la muestra aparece
  iluminada sobre un fondo oscuro.
• 1.4.1.3. M. de Contraste de Fases se basa en que
  las diferentes estructuras celulares tienen
  distinta densidad y, por tanto, varía su índice
  de refracción.
• 1.4.1.4. M. de Interferencia Diferencial de
  Nomarsky utiliza un prisma refringente que
  divide la luz en dos rayos polarizados que
  interfieren entre sí, rpoporcionando una imagen
  de la célula que parece tridimensional.

56
Funcionamiento del microscopio de campo oscuro
57
Qué microscopio se ha utilizado?
58

• Fibroblasto en cultivo. A) Microscopía de campo
  claro (B) Microscopía de contraste de fase (C)
  Microscopía diferencial de contraste de
  interferencia (DIC) Nomarski. (D) Microscopía
  de campo oscuro (tomada de Alberts y col.,
  Molecular Biology of the Cell, 2004)

59
1.4.1.TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

• 1.4.1.5. M. de Fluorescencia emplea una lámpara
  especial y un filtro que permiten emitir luz a
  diferentes longitudes de onda y excitar ciertas
  moléculas (fluorocromos) capaces de emitir
  fluorescencia (absorción de una determinada ? y
  emisión de luz de una ? mayor ? visible)

El microscopio de fluorescencia Olympus BX61,
acoplado con una cámara digital
60
Microscopía de fluorescencia
61
Microscopía de fluorescencia
62
Microscopía de fluorescencia

• Se observa una micrografía de una célula en
  mitosis. Para obtener esta imagen, se emplearon
  tres moléculas fluorescentes distintas con el fin
  de teñir tres componentes celulares diferentes.
  Se usó un anticuerpo acoplado a una proteína
  fluorescente verde para detectar a los
  microtúbulos, otro anticuerpo acoplado a una
  proteína fluorescente roja para detectar a los
  centrómeros, y un colorante fluorescente azul
  para teñir el ADN, que se encuentra condensado
  formando los cromosomas. (Fuente Alberts y col.,
  Molecular Biology of the Cell, 2004).

63
1.4.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

• Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz
  de luz. Como la longitud de onda de los
  electrones es menor que la de la luz, el poder de
  resolución aumenta considerablemente (unos 0,2
  nanómetros).
• El haz debe proyectarse en un sistema al vacío.
• Las lentes de cristal son sustituidas por lentes
  electromagnéticas (electroimanes).
• Existen dos tipos de microscopios electrónicos
  el de transmisión (TEM) y el de barrido (SEM).

64
1.4.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
65
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)
El haz de electrones atraviesa la muestra. El haz de electrones no atraviesa la muestra.
La imagen se forma por la dispersión de los electrones en función del espesor, de la densidad molecular y del nº atómico de los átomos de la muestra. La imagen se forma por el reflejo del haz de electrones al incidir sobre la superficie de la muestra en función del relieve ? IMAGEN TRIDIMENSIONAL.
Se le añaden átomos pesados para acentuar la dispersión electrónica. Previamente a la observación se realiza la vaporización de un metal pesado
66
QUÉ MICROSCOPIO SE HA UTILIZADO?
Detalle de una célula
C. albicans en estado reproductivo
67
QUÉ MICROSCOPIO SE HA UTILIZADO?
Alga unicelular
Ameba
68
QUÉ MICROSCOPIO SE HA UTILIZADO?
Mycobacterium tuberculosis
ASTROCITO
69
QUÉ MICROSCOPIO SE HA UTILIZADO?
Leptospirillum
70
1.4.2.1. Técnicas específicas de microscopia
electrónica.

• Difracción de rayos x
• Criofractura

Zónula ocluyente de epitelio
71
2. FRACCIONAMIENTO CELULAR. CITOQUÍMICA
El objetivo del fraccionamiento celular es
disgregar las células separando los orgánulos
principales de modo que, sus funciones
individuales puedan ser estudiadas. El
instrumento usado para fraccionar las células es
la centrífuga capaz de girar a diversas
velocidades. La más poderosa, llamada
ultracentrífuga puede dar vueltas tan rápidamente
como 80000 revoluciones por minuto (RPM)
72
(No Transcript)
73
2. FRACCIONAMIENTO CELULAR. CITOQUÍMICA

• De estas fracciones se pueden obtener muestras
  puras de los diversos componentes celulares
  mediante técnicas bioquímicas como
• Cromatografía separa los componentes de una
  mezcla de sustancias haciendo que éstas se
  desplacen por un medio como, por ejemplo, papel.
• Electroforesis separa proteínas según la carga,
  ya que las hace desplazarse en un campo
  eléctrico.
• Coloración consiste en hacer visible los
  compuestos químicos conociendo sus diferentes
  afinidades tintoriales.
• Marcaje con isótopos. (AUTORRADIOGRAFÍA)
• Inmunocitoquímica..

74
3. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS.

• Cultivar células en el laboratorio permite
  contar con poblaciones homogéneas de células
  vivas, interactuando unas con otras en
  condiciones controladas, en las que pueden
  realizarse diferentes estudios experimentales. En
  este sentido, la manipulación de células resulta
  mucho más sencilla y precisa que el trabajo con
  animales de laboratorio además, representa una
  posibilidad éticamente aceptada de realizar
  experimentación con células de origen humano.

75
3.1. Aislamiento de células pasos

1. Reducir el tejido a una suspensión de células
   libres. Esto se consigue utilizando medios
   químicos que provocan la disgregación de las
   células.. (Por ej. Tripsina)
2. Aislamiento de cada tipo de ellas, lo que puede
   hacerse separando las células más grandes o las
   más densas...o mediante citómetro.
3. Actualmente se cuenta con aparatos que realizan
   una separación automática muy precisa y rápida,
   son los llamados clasificadores celulares
   activados por fluorescencia, o citómetros.

76
Citómetro

• Separa células previamente disgregadas, algunas
  de las cuales se han marcado específicamente con
  fluorescencia. Las células están contenidas en un
  medio líquido, en muy baja concentración, y pasan
  por el aparato dentro de pequeñas gotitas, cada
  una de las cuales contiene sólo una célula, o
  ninguna. Por medio de un rayo láser, el citómetro
  detecta la presencia o no de fluorescencia,
  proporcionando una carga eléctrica distinta según
  el caso, lo que permite la clasificación final de
  las células.
• Los citómetros permiten también realizar el
  recuento de las células mientras se realiza la
  separación. Esta técnica es llamada citometría de
  flujo, y se la utiliza en investigación y en
  análisis para el diagnóstico médico oncológico o
  inmunológico. Una vez aisladas las diferentes
  poblaciones de células, pueden utilizarse
  directamente para análisis bioquímico, o bien
  destinarse al cultivo celular in vitro.

77
(No Transcript)
78
3.2. Cultivo de células

• Los cultivos se realizan dentro de recipientes de
  vidrio o plástico (generalmente cápsulas de Petri
  o botellas).
• Los materiales a ser cultivados (células de uno o
  más tipos, tejidos, o bien órganos o trozos de
  órganos) deben extraerse y mantenerse en
  soluciones similares a los líquidos tisulares, en
  condiciones estériles para evitar el crecimiento
  de bacterias u hongos.
• Las células aisladas pueden cultivarse en
  suspensión, flotando en el medio, o bien
  adheridas a una superficie de vidrio o plástico.
  Sobre este sustrato las células crecen formando
  una capa única o monocapa.
• Los cultivos celulares pueden observarse en
  cualquier momento en que sea necesario,
  utilizando contraste de fases en "microscopios
  invertidos". Estos son aparatos adaptados
  especialmente para la visualización de materiales
  de considerable grosor para ello los objetivos
  están situados debajo de la platina y la
  iluminación se realiza desde arriba de la misma.

79
(No Transcript)
80
4. Localización de moléculas biológicas por
medio de isótopos radioactivos o anticuerpos
marcados.
4.1. Autorradiografía 4.2. Inmunocitoquímica
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4.1. Autorradiografía

• Consiste en incubar las células en presencia de
  determinados isótopos radiactivos que podrán ser
  incorporados a determinadas moléculas.
• Estos radioisótopos son instables y emiten
  radiaciones ionizantes que se pueden registrar
  con aparatos, como el de Geiger, o bien mediante
  su impresión en una película fotográfica.

82
4.2. Inmunocitoquímica

• La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo
  puede aprovecharse para poner en evidencia,
  específicamente, una molécula determinada, en una
  célula o tejido. Así puede saberse el tipo de
  actividad de esa célula, o distinguirla de otras.
  Para ello se utilizan anticuerpos marcados que se
  unen específicamente a determinadas moléculas de
  dicha célula, las que son reconocidas como
  antígenos.

83
(No Transcript)