Diapositiva 1

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COLTIVAZIONE DEI BATTERI Substrati di
crescita Terreni di coltura 1. terreni
definiti si conosce l'esatta composizione
chimica Es. Terreno per Escherichia
coli quantità
(g/l) Glucosio
1,0
Na2HPO4
16,4 KH2PO4

1,5 (NH4)2SO4

2,0 MgSO4.7H2

200,0 CaCl2
10,0
FeSO4. 7H2O
0,5 PH
finale 6,8-7,0
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b) Terreni complessi la composizione chimica di
alcuni componenti non è esattamente
conosciuta Es. Alcuni tra i più comuni
terreni complessi Brodo nutritivo

quantità (g/l) Peptone (idrolisato di
gelatina)
5 Estratto di carne di manzo
3 TSB
(Tryptic Soy Broth) Triptone (digesto
pancreatico della caseina) 17
Peptone (digesto della farina di soia)
3 Glucosio

2,5 Cloruro di sodio

5 Fosfato di potassico
2,5
Agar MacConkey
quantità (g/l) Digesto
pancreatico di gelatina
17,0 Digesto pancreatico di caseina
1,5
Digesto peptico di tessuto di animale
1,5 Lattosio

10,0 Sali biliari

1,5 Cloruro di sodio
5,0
Rosso neutro
0,03 Cristal
violetto
0,001 Agar

13,5
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Stato fisico dei terreni A-Terreni
liquidi B-Terreni solidi a base di agar o di
gelatina Agar miscela di polisaccaridi
estratti da alghe rosse Punto di
fusione gt 80C Punto di
solidificazione lt 45C Aggiunto
nella proporzione dell1-2 (0,5 per terreni
semisolidi) Tranne alcuni
batteri marini, i batteri non possiedono enzimi
in grado di attaccare lagar
Gelatina sostanza di natura proteica che si
ottiene per azione dellacqua
bollente sui collageni Punto
di fusione e di solidificazione 25C
Aggiunta nella proporzione del 10-20
I terreni a base di
gelatina si usano per identificare i batteri che
Possiedono enzimi in grado di
attaccare la gelatina (batteri
fluidificanti la gelatina)
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Terreni colturali liofilizzati
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Crescita in terreno liquido lo sviluppo
batterico è evidenziato da
intorbidamento del
terreno Crescita su terreno solido lo sviluppo
batterico dà origine alla formazione
di colonie o di
patina
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Tipi di terreno A-Terreni di base (es. Triptic
soy broth)) di uso generale. Consentono la
crescita di molti microrganismi B-Terreni
arricchiti al terreno base si aggiungono varie
sostanze a seconda delle esigenze
nutrizionali del batterio es latte, sangue,
vitamine, aminoacidi, ecc. C-Terreni di
arricchimento terreni selettivi liquidi nei
quali lo sviluppo del batterio che si vuole
isolare è favorito rispetto a quello dei
contaminanti. Si fa seguire una sottocoltura
in terreno selettivo solido.
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D-Terreni selettivi contengono sostanze
batteriostatiche nei confronti della flora
microbica contaminante ma senza azione nei
confronti del batterio ricercato che è
quindi favorito nello sviluppo. E-Terreni
indicatori oltre ai normali costituenti
contengono sostanze che sono modificate in
maniera facilmente apprezzabile dal batterio
ricercato o dai batteri contaminanti in modo che
le colonie degli uni siano facilmente
evidenziabili dalle colonie degli altri. Es.
Gli enterobatteri patogeni non fermentano il
lattosio Escherichia coli fermenta il
lattosio con produzione di metabolici acidi che
sono messi in evidenza con un indicatore di
pH
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Nutrient agar le colonie crescono indifferenziate
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A
B Agar Eosina Blu
di Matilene (EMB) Blu di metilene inibisce la
crescita della maggior parte dei batteri Gram
positivi Eosina colorante che passa da incolore
a nero quando il mezzo diventa acido A-Batteri
lattosio non fermentanti colonie
incolori B-Batteri lattosio fermentanticentro
scuro con riflessi verde metallico delle colonie
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B
A
Agar Salmonella Shigella (agar SS) Sali biliari
inibiscono la maggior parte dei Gram
positivi Rosso neutro indicatore rosso a pH
acido e incolore a pH
basico A- batteri lattosio fermentanti B- batteri
lattosio non-fermentanti C-batteri lattosio non
fermentanti produttori di acido solfidrico
C
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pH Si controlla il pH mediante
pHmetro Laggiustamento del pH si fa mediante
aggiunta di NaOH o HCl diluiti Al terreno si
possono aggiungere indicatori di pH per
evidenziarne le variazioni es. Blu di
bromotimolo Rosso
metile Rosso congo
Rosso fenolo
Rosso neutro I terreni prima della
semina del campione devono essere sterili In
genere sono sterilizzati in autoclave I terreni
acquosi contenenti sostanze termolabili sono
sterilizzati per filtrazione La vetreria è
sterilizzata mediante aria calda (stufe a secco)
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I terreni prima della semina del campione devono
essere sterili STERILIZZAZIONE ha lo scopo di
distruggere qualsiasi
microrganismo presente in un dato
materiale DISINFEZIONEha lo scopo di
distruggere microrganismi patogeni ANTISEPSI
tende a distruggere microrganismi sulla cute,
ferite, sostanze
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Sterilizzazione A- Calore Il calore agisce
denaturando le proteine e disgregando la membrana
citoplasmatica I vari microrganismi possiedo
diversa sensibilità al calore Tempo di morte
termicatempo richiesto per sterilizzare una
sospensione microbica ad una determinata
temperatura
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Tempi di morte termica approssimativi per
microrganismi con diversa resistenza

Acqua
Vapore
Calore secco bollente
sotto ressione
160C 180C
100C 121C 132C
min
min min min
min Molto sensibile Batteri
asporigeni Virus
3 lt1 2
1 lt1
Miceti Poco resistente Clostridium
perfingens (spore)
4 lt1 5
2 lt1
Virus dellepatite Moderamente resistente
Clostridium septicum
(spore) 4 lt1
10 3
lt1 Bacillus anthracis
(spore) Molto resistente
B.stearothermophilus Clostridium
botulinum 30 5
30 12 2
(spore) Termofili del
terreno 60 10 lt500
25 4
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1- Calore secco - Incenerimento - Flambaggio -
Aria calda Metodo di scelta per la
sterilizzazione di vetreria di laboratorio,
siringhe di vetro, materiale di porcellana,
ecc. Si usano particolari stufe a doppia
parete I genere si sterilizza a 160C per 2
ore 180C
per 1 ora
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2-Calore umido A-Acqua bollente 100C per
5-10 minuti non si ottiene la
sterilizzazione Si può aumentare lazione
microbicida aggiungendo disinfettanti
chimici B-Vapore Deve essere - Privo di
aria Impedisce al vapore di venire a
contatto con il materiale La temperatura è
quella della miscela aria e vapore - Saturo
e non surriscaldato deve avere una
temperatura non superiore a quella corrispondente
a una data pressione
temperatura
pressione (Atm) 100
0,00
112
0,5
121
1 128
1,5
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1-Vapore fluente Pentola di Koch
100C per 30-60 minuti Le spore
batteriche non vengono uccise
Tindalizzazione Consiste nel
riscaldamento di materiali organici per 20-45
minuti, ripetuto per tre giorni di
seguito ? si ottiene luccisione
delle spore
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2-Vapore sotto pressione Autoclavi
apparecchi a perfetta tenuta resistenti alla
pressione Sono
provviste di Termometro
Manometro

Rubinetto di espurgo
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• Il ciclo di sterilizzazione comprende 4 fasi
• 1- Caricamento del materiale
• Il materiale non deve essere ammassato
• 2- Riscaldamento preliminare
• Si portano temperatura e pressione ai
  livelli desiderati
• I tappa si scalda a 100C con lorificio
  di espurgo aperto
• II tappa si chiude lorificio di espurgo
• La temperatura sale fino al
  livello richiesto
• 3-Sterilizzazione
• temperatura e pressione sono mantenuti a
  livelli costanti per un determinato periodo
• tempi di sterilizzazione
• 121C per 15 minuti
• 115C per 30 minuti
• 4- Raffreddamento

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B-Filtrazione Per soluzioni acquose
termolabili
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Sterilizzazione dell'ambiente di lavoro A- Raggi
ultravioletti (260 nm) Sono caratterizzati
da - lenta attività d'azione - scarso
potere di penetrazione ( non attraversano vetro,
superfici solide, strati di sporco,
ecc.) Lampade UV sono applicate al soffitto
delle stanze o nelle cabine a flusso
laminare Il personale non deve essere
esposto in quanto i raggi UV provocano
ustioni della cute e danneggiano gli occhi
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B- Cappe a flusso laminare
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Semina Su terreno solido a) disseminazione
in superficie
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Semina per disseminazione in superficie
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B) semina per inclusione Il campione deve
essere liquido
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Semina per inclusione
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Condizioni di incubazione Vanno rispettate le
esigenze di crescita dei batteri (temperatura e
atmosfera. Per i batteri anaerobi si deve
garantire l'assenza di ossigeno
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La semina in un terreno di coltura premette 1.La
conta batterica A-Carica batterica totale su
tereni solidi
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2. Isolamento e identificazione
L'identificazione dei batteri si esegue su
coltura pura terreni contenenti una sola
specie batterica si ottiene prelevando una
sola colonia cresciuta su tereno solido e la si
semina in un altro terreno Si basa
su 1- attività metabolica dei batteri A-
inoculo di una porzione di colonia sospetta in
una serie di terreni di coltura
contenenti substrati particolari e indicatori che
evidenziano le variazioni di pH e la
presenza di cataboliti
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B- Sistemi di identificazione rapida es. API
20E API 20 non E
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2- carattere morfologico Osservazione
microscopica dei batterì 3- carattere
antigenico 4- carattere genetico Studio di
specifiche sequenze del DNA