Ing. Pavl

1
Biosenzory
Senzory pro monitorování vnejšího
prostredí Senzory pro monitorování prostredí v
organismu

• Ing. Pavlína Šobrová
• Fakulta chemická, VUT v Brne

2
OBSAH

• Základy
• Aplikace
• Shrnutí

3
Biosenzory
4
Definice
Sensor - soucást zarízení pro snímání fyzikálních
velicin. Jde zpravidla o prevodníky sledovaných
fyzikálních velicin na elektrické napetí nebo
elektrický proud pro další zpracování v merících
a rídících systémech, robotech, bezpecnostních
zarízeních a podobne Velký slovník naucný,
DIDEROT (1999). Biosensor - biologická soucást
(napr. enzym, protilátka) navázaná na
elektroanalytické cinidlo. Interakcí analytu
s biologickou komponentou je generován elektrický
signál, který je zesílen a odecten Velký slovník
naucný, DIDEROT (1999). Biosensor je analytický
prístroj obsahující citlivý prvek biologického
puvodu, který je bud soucástí nebo v tesném
kontaktu s fyzikálne-chemickým prevodníkem.
Poskytuje prubežný elektronický signál, který je
prímo úmerný koncentraci jedné nebo nekolika
(skupin) chemických látek ve vzorku Rechnitz G.
A. Electroanalysis 3, 73 (1991).
5
Úskalí definice
Predstavme si skupinu osob osob rozptýlených
náhodne po poli, pricemž každá z nich má telefon
a hlásí pozorování podmínená cichem, sluchem,
chutí a dotykem. Takový soubor pozorovatelu muže
poskytovat informace o povaze, intenzite,
prostorovém umístení a casovém prubehu chemických
stimulu v daném prostoru. Pritom to bude
biosensor - má rekognicní element (lidé) i
prevodník (telefony).
Co z toho vyplývá?

• Pojem biosensor je
• široce použitelný
• nemusí popisovat pouze zarízení vyrobená
  clovekem.

6
Historické milníky

• Jaroslav Heyrovského objev polarografie v roce
  1922.
• Koncentrace kyslíku v biologických tekutinách
  pomocí rtutové kapkové elektrody (Müller a
  Bamberger, 1935) a spotreby kyslíku živými
  organismy (sinice, kvasinky a krevní bunky,
  Petering a Daniels, 1938).
• Revolucní zmenu techto sensoru provedl v roce
  1956 Leland C. Clark Jr. predradil elektrodovému
  systému membránu propustnou pro plyny, a tak
  elektrody (pracovní zlatá nebo platinová katoda
  zatavená ve skle a argentchloridová referentní)
  fyzikálne isoloval od mereného prostredí. Tím
  získal spolehlivý merící systém vedoucí k mnoha
  aplikacím a ke zrodu biosensoru.

7
Historické milníky
Leland C. Clark Jr.
8
Historické milníky

• Clark s Lyonsem poprvé uvedli termín enzymová
  elektroda (1962).
• Updike a Hicks propracovali experimentální
  detaily potrebné k získání funkcní enzymové
  elektrody pro glukózu.
• První enzymové elektrody se objevují na prelomu
  50. a 60. let jako "akademická kuriozita" zprvu
  provázená neduverou.
• První komercní biosensor pro glukózu uvedla na
  trh úspešne firma Yellow Springs Instrument
  Company (Ohio) v roce 1975.
• Objevuje se název biosensor (puvodne byla snaha
  použít "bioprobe", tento název však byl chránen).

9
Historické milníky

• Lubbers a Opitz zavádí pojem optoda pro sensory
  na bázi optických vláken (1975).
• Dalším mezníkem je rok 1982, kdy Schichiri popsal
  implantovatelný glukosový biosensor jehlovou
  enzymovou elektrodu.
• Koncem 70. let zacíná výzkum imunochemických
  biosensoru (imunosensoru), na pocátku soucasného
  komercního úspechu afinitních biosensoru byla
  práce Liedberga který navrhnul sledování
  afinitních interakcí v reálném case pomocí
  rezonance povrchových plasmonu ve vrstve kovu
  nanesené na optickém rozhraní
• Dosud nejúspešnejší biosensor je založen na
  ferrocenu - prenašeci elektronu z oxidoreduktáz
  na elektrodu.

10
Glukometry
11
Základní pojmy

• Citlivost je konecná ustálená zmena výstupního
  signálu biosensoru (S) v dusledku zmeny
  koncentrace analytu (c), tj. ?S/?c, nebo dS/dc.
  Pri provádení kinetických merení (sleduje se
  casová zmena signálu dS/dt) se citlivost vypocítá
  jako ?(dS/dt)/?c. Nekdy se používá transformovaný
  signál, napr. pri potenciometrických mereních ln
  S. Speciálními druhy signálu mohou být plocha
  (casový integrál), frekvencní analýza apod.
  Signál by mel být tak velký, aby šel dobre merit.
  V ideálním prípade by citlivost mela být
  konstantní po celou dobu životnosti biosensoru. V
  reálných systémech se zmeny citlivosti kompenzují
  rekalibrací.

12
Základní pojmy

• Kalibrace spocívá ve vystavení biosensoru ruzným
  standardním roztokum o známé koncentraci analytu.
• Kalibracní body by mely uzavírat pracovní oblast
  biosensoru, aby nebylo treba provádet
  nespolehlivé extrapolace. Je vhodné použít co
  nejméne kalibracních bodu, pokud je znám tvar
  kalibracní závislosti (nejvhodnejší je samozrejme
  prímka), stací 1 nebo 2 body.
• V ideálním prípade by stacilo provést kalibraci
  pouze 1x pro nový biosensor, prakticky je nutné
  tento proces periodicky opakovat.

R2 0.9825 Rostoucí trend
R2 0.9912 - Lineární
R2 0.9953 Striktne lineární
13
Základní pojmy

• Limit detekce (LOD, limit of detection)
  biosensoru je nejnižší stanovitelná koncentrace
  analytu. Ideálne je dán rozlišením elektronického
  merícího prístroje, obvykle je zhoršován
  vedlejšími procesy.
• Signál pozadí, (background) je signál v
  neprítomnosti analytu, obvykle se automaticky
  odecítá od mereného signálu S S(merený) -
  S(pozadí). V nekterých prípadech je výhodnejší
  použít referentní koncentraci analytu a vuci ní
  vztáhnout merený signál. Pro semilogaritmický
  prípad pak dostáváme S/S(ref)
  (merení-pozadí)/(reference-pozadí). Obvykle se
  predpokládá stabilita signálu pozadí, to však v
  praxi nemusí být pravda (signál pozadí obvykle
  casem klesá).

14
Základní pojmy

• Hystereze oznacuje vliv minulých merení na
  aktuální signál. Ideálne by mela být nulová.
  Pozná se ze zmeny tvaru kalibracních krivek -
  objevuje se na nich konkávní resp. konvexní
  prohyb. Duvodem muže být to, že vysoká
  koncentrace analytu muže narušit okolí biosensoru
  nebo prostredí uvnitr biorekognicní vrstvy
  (nahromadení produktu reakce, lokální zmeny pH ci
  teploty) a to ovlivní následující merení. Vliv
  hysterese se muže omezit zpomalením merení (je
  cas na vyrovnání zmen).
• Dlouhodobá stabilita, (drift) je podmínena
  zmenami citlivosti biosensoru v case. Citlivost
  obvykle klesá, ale muže prechodne i vzrust (zmena
  biovrstvy - ztencení, nabobtnání). Postupný
  pokles citlivosti muže být vyvolán oxidaxí
  povrchu kovových elektrod, usazováním vrstev
  proteinu ci jiných biomolekul (merení in vivo),
  otrava biovrstvy težkými kovy. Skokové zmeny jsou
  vyvolány mechanickými vlivy, mohou casto uniknout
  pozornosti. Vždy je proto provádet kontrolu
  citlivosti a prípadne provést rekalibraci.

15
Základní pojmy

• Selektivita (vliv interferencí). Odezva
  biosensoru by mela být vyvolána pouze prítomností
  stanovované látky, ostatní látky by se nemely
  projevit. Prakticky je casto nutné rušivé látky
  eliminovat (zredení, konverse na nerušící
  slouceniny, predrazení selektivní bariéry) nebo
  jejich príspevek 10 na merený signál paralelne
  urcit jiným sensorem. Pri tomto diferenciální
  usporádání se použijí dva stejné prevodníky,
  avšak biorekognicní vrstvou je pokrytý pouze
  jeden. Druhý slouží jako referentní, lze ho
  povléct vhodnou indiferentní vrstvou pro
  vyrovnání difúzních podmínek.

16
Základní pojmy

• Rychlost odezvy je urcována zejména fyzikálními
  vlastnostmi biosensoru (velikost). Závisí na
  rychlosti difúze analytu z okolního prostredí k
  povrchu biosensoru a dále pak vnitrní difúzí
  uvnitr systému biosensoru. Uplatnují se
  koncentrace analytu, velikost difúzních
  koeficientu, délka difúzní dráhy (pocet vrstev
  biosensoru). Z praktického hlediska je výhodné,
  pokud odezva je limitována difúzí a nikoliv
  rychlostí bioreakce.
• Životnost biosensoru je obykle limitována
  neslabším prvkem, což je biorekognicní cást.
  Pritom je treba odlišit stabilitu pri skladování
  (shelf life) od operacní stability, která muže
  být závislá na poctu a druhu analysovaných
  vzorku. Pro dlouhodobé uložení biosensoru je
  obecne vhodná nižší teplota (chladnicka,
  mraznicka), z praktického hlediska je pohodlnejší
  skladování v suchém stavu. Optimální podmínky je
  treba vždy hledat individuálne.

17
Základní pojmy

• Biokompatibilita má zvláštní význam pro
  biomedicínské aplikace (merení in vivo). Pri
  umístení biosensoru prímo v krevním toku je treba
  zamezit srážení krve (impregnace heparinem), ve
  tkáních hrozí nebezpecí zánetlivých reakcí,
  zajizvení a zarustání pojivovou tkání. Prípadná
  sterilizace biosensoru nesmí negativne ovlivnit
  jeho aktivitu.

18
Podmínky merení s biosensory

• Prímý kontakt se vzorkem. Biosensor se nachází
  prímo ve sledovaném prostredí (reka, tkán, krevní
  recište, fermentor, ...). Pritom by jeho cinnost
  nemela okolní prostredí ovlivnit - vycerpávání
  analytu dusledkem merení, ovlivnení toku jiných
  látek. Pri tomto zpusobu použití muže být
  užitecné menit polohu biosensoru, tak lze získat
  dodatecné informace o distribuci analytu v
  prostredí a odhalit prípadné existující
  koncentracní gradienty.
• Uzavrená nádoba. Biosensor je umísten ve vhodné
  nádobce (casto opatrená vodním pláštem pro
  temperaci a magnetickým míchadlem).
• Prutocný systém. Biosensor je umísten ve vhodné
  prutocné cele. Jsou možné dva zpusoby cinnosti.
  Systémem se nechá strídave protékat zóna
  základního roztoku a zóny vzorku.

19
PRINCIP FUNKCE BIOSENSORU
Enzym
elektroaktivní substance
elektroda
Peptid
Protein
zmena pH
pH elektroda
Elektrický signál
Bunka
termistor
teplo
Protilátka
svetlo
foto-dioda
DNA
piezoelektrické zarízení
zmena hmoty
Mikro- organismus
Prevodník signálu fyzikálne chemická cást
Bioreceptor biologická cást
Stanovovaná látka
20
Delení biosensoru podle biologické
(biorekognicní) cásti
Biokatalytické Biologická složka enzym,
organela, bunka, tkán, organismus Stanovovaná
složka je premenována v prubehu chemické reakce
stanovovaná látka obvykle vystupuje jako substrát
enzymové reakce. Bioafinitní Biologická složka
lektin, protilátka, nukleová kyselina,
receptor. Stanovovaná látka je specificky vázána
ve vznikajícím afinitním komplexu.
21
Delení prevodníku
Prevodníky pro biokatalytické sensory
Elektochemické systémy (napr. referentní
elektrody, pomocné elektrody) Potenciometrické
bioelektrody (napr. ISE) Amperometrické
bioelektrody Optické (napr.
chemiluminiscence, bioluminiscence)

• Prevodníky pro bioafinitní sensory
• Optické
• Piezoelektrické systémy

22
Biosensory na bázi elektrod pro kyslík a peroxid
vodíku

• Pracovní elektrodou je zlatý nebo platinový
  drátek (prumer 0.1 až 5 mm dle žádané citlivosti)
  zatavený ve skle, potenciál pro redukci kyslíku
  je kolem -650 mV vzhledem k vnitrní Ag/AgCl
  referentní elektrode.
• Klícovou soucástí je membrána propustná pro
  kyslík. Jako materiál se používá teflon
  (nejlepší, rychlá odezva, dobrá propustnost pro
  O2), dále pak polypropylen a polyethylen.
• Elektrodová redukce kyslíku je ctyrelektronový
  proces
• O2 2 H2O 2 e- ? H2O2 2 OH-
• H2O2 2 e- ? 2 OH-

23
Biosensory na bázi elektrod pro kyslík a peroxid
vodíku

• Sensory jsou použitelné pro biosensory
  využívající enzymy oxidázy jako biorekognicní
  element. Tyto enzymy oxidují molekulu substrátu
  (analytu) za úcasti kyslíku, pritom vzniká bud
  peroxid vodíku nebo voda
• Substrát O2 ? Produkt H2O2
• Substrát O2 ? Produkt H2O
• První reakce je typická zejména pro oxidasy s
  flavinovým koenzymem (obvykle žluté barvy, napr.
  glukóza oxidáza, laktát oxidáza), druhý typ
  prevažuje napr. u kuproteinu (tyrosináza).

24
Biosensory na bázi elektrod pro kyslík a peroxid
vodíku
25
Enzymové biosensory

• Biokatalytické sensory mají jako rekognicní
  element enzym - bílkovinu schopnou biokatalyticky
  premenit urcitý specifický substrát na produkt.
• Analyt u enzymových biosensoru vystupuje
  nejcasteji jako substrát imobilizovaného enzymu.
• Nejbežnejší látkou detekovanou pomocí biosensoru
  je glukóza.
• Dále to muže být fruktóza, sacharóza, laktóza,
  škrob, vitamín C, ethanol, kyselina siricitá
  (víno).

26
Prevodníky pro bioafinitní sensory

• Afinitní biosensory využívají jako rekognicní
  složku biomolekuly schopné specificky vytváret
  komplex s analytem, který je strukturne
  komplementární k vazebnému místu imobilizované
  biomolekuly.
• Typickým príkladem je vznik imunokomplexu mezi
  antigenem a protilátkou nebo hybridizace
  nukleových kyselin.
• Mnohem casteji se však ve výzkumné oblasti
  provádí strukturní studie a studium bioafinitních
  interakcí (charakterizace protilátek, mapování
  vazebných míst), poslední dobou také hledání a
  soucasná charakterizace biomolekul pripravovaných
  kombinatorickými postupy nebo z genetických
  knihoven.
• Protilátky a imunosensory.

27
Receptory a lipidové vrstvy

• Receptorové biosensory. Tato oblast chce využít
  vysoce ciltivé cichové systémy živocichu pro
  konstrukci umelého nosu (artificial nose). První
  pokusy se provádely s cichovými tykadly drobných
  morských krabu (crayfish, Callinectus sapidus).
  Potenciál výstupního nervu se meril pomocí
  mikroelektrody a sledovala se frekvence pulsu v
  závislosti na pritomnosti stimulujících látek.
• Výstupní frekvence pulsu potenciálu narustala v
  prítomnosti stimulujících fyziologických látek
  (puriny, aminokyseliny, peptidy). Mimo to byl
  sledován signál na farmaceutické preparáty
  (léciva, drogy) a toxické látky.

28
Receptory a lipidové vrstvy

• Lipidové vrstvy. Pro mnohé bílkoviny je
  prirozeným prostredím biomembrána, obsahující
  hydrofobní zbytky lipidových retezcu. Struktura
  biomembrány je založena na lipidové dvojvrstve
  (BLM, bilayer lipid membrane).
• Hydrofilní biomolekuly lze na povrchu BLM
  prichytit pomocí krátké hydrofobní "kotvy", tento
  princip lze využít i pro jejich imobilizaci. V
  oblasti biosensoru hrály BLM dlouho méne
  významnou roli, což souviselo s jejich nízkou
  stabilitou (nekolik hodin za bežných podmínek).
  Poslední dobou se zacínají uplatnovat mnohem
  více, protože se podarilo zlepšit 103 jejich
  mechanickou stabilitu prípravou na podpurném
  povrchu (sBLM, supported BLM). Výhodou je
  reprodukovatelná príprava, vysoká orientovanost a
  definovaná tlouštka.
• Originální koncept biosensoru na bázi lipidové
  dvojvrstvy byl vyvinut v Austrálii, funguje jako
  jistý druh prevodníku pro sledování interakcí
  biomolekul.

29
Nukleové kyseliny

• Biosensory pro detekci nukleových kyselin nebo s
  nukleovými kyselinami jako biorekognicním
  elementem byly pomerne dlouhou dobu mimo hlavní
  oblast zájmu a výrazneji se prosazují až od
  pocátku 90. let. Stimulem rozvoje této oblasti
  biosensoru bylo hledání rychlejších sekvenacních
  metod potrebných pri celosvetovém projektu
  sekvenace lidského genomu.
• V oblasti aplikací se objevila potreba detekovat
  mutacní poškození duležitých genu, které se
  projevuje metabolickými poruchami. Potrebnou
  citlivost biosensory pro detekci DNA získávají
  díky spojení s polymerázovou retezovou reakcí.

30
Aplikace biosensoru pro detekci DNA

• urcování príbuzenských vztahu HLA komplex,
  oblast D-smycky mitochondriální DNA, délkový
  polymorfismus (VNTR místa).
• detekce onkogenu a supresorových genu zhoubného
  bujení c-myb, c-myc, c-ras, G protein, jun, p53,
  retinoblastomové geny.
• dedicné choroby cystická fibróza,
  hypercholesterolemie, Huntingtonova choroba,
  sicklecell anemie, Duchenneova svalová dystrofie,
  ß-thalassemie, polycystická porucha ledvin,
  hyperchromatosis, hemofilie A, Von Willebrandtova
  nemoc.
• viry cytomegalovirus, lidský papilomový virus,
  rotaviry (RNA), HIV, lidský virus leukemie
  T-lymfocytu.
• bakterie Mycobacterium tuberculosis, Gonorrhea
  (RNA, DNA), Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia,
  Escherichia coli (RNA), Bacillus subtilis (RNA),
  Bacillus burgdorferi.

31
Využití biosensoru oblasti
Klinická oblast nejvetší pole využití pro
biosensory velmi lukrativní trh, rocní objem
penez investovaných do klinických testu již dnes
presahuje 10 mld USD konkrétní príklady
osobní glukometry diabetiku tehotenské
testy stanovení alkoholu atd.

• Potravinárství a fermentacní prumysl
• potenciální trh
• konkrétní príklady systém detekce bakterií.
• výhledy sensorické hodnocení potravin (umelý
  nos a umelý jazyk)
• kontrola cerstvosti potravin.

32
Využití biosensoru oblasti

• Vojenská a bezpecnostní oblast
• velký zájem ze strany armád ruzných zemí
• konkrétní príklady detektor NAIAD, který
  elektrochemicky detekuje aktivitu cholinesterázy
  slouží pro detekci nervove paralytických
  sloucenin jako jsou sarin a soman
• výhledy detekce výbušnin
• detekce drog pri celních kontrolách
• detekce chemických a biologických zbraní.

• Bioafinitní systémy pro výzkum
• detekce širokého spektra látek od peptidu,
  proteinu a léciv, pres nukleové kyseliny až po
  samotné prvky jakou jsou težké kovy.

33
Praktické aplikace Težké kovy
34
TEŽKÉ KOVY

• Prvky s hustotou vyšší než 5 g.cm-3.
• Delíme je na esenciální a toxické.
• Esenciální vlastnosti soucásti biologicky
  významných látek (napr. zinkové prsty),
  katalyzátory atd.
• Toxické vlastnosti narušení životne duležitých
  biochemických cest, souperení s esenciálními
  kovy smrt organismu.

esenciální kov
toxický kov
2
35
CÍLE PRÁCE

1. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
   biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
2. Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat
   pro detekci kademnatých a zinecnatých iontu
3. Využít kovy vázající protein metalothionein jako
   další biologickou složku biosensoru
4. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
   aplikovat pro detekci kademnatých a zinecnatých
   iontu, a cisplatiny
5. Studovat interakci cisplatiny s DNA

3
36
CÍLE PRÁCE

1. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
   biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
2. Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat
   pro detekci kadmia a zinku
3. Využít kovy vázající protein metalothionein jako
   další biologickou složku biosensoru
4. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
   aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
5. Studovat interakci cisplatiny s DNA

4
37
I. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
Fytochelatin rostlinný peptid

• Významný rostlinný peptid, který má základní
  strukturu (g-Glu-Cys)n-Gly.
• Dipeptidická repetice glutamové kyseliny a
  cysteinu (g-Glu-Cys) se muže opakovat 2 až
  11krát.
• Molekula glutathionu (?-Glu-Cys-Gly) je
  substrátem pro syntézu fytochelatinu.
• Hlavní funkce této skupiny peptidu je detoxikace
  težkých kovu, která probíhá vazbou na thiolové
  skupiny peptidu schopnost interakce.

5
38
I. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
Modifikace elektrody
1 mM
Výška píku (nA)
10 µM
Doba akumulace (s)
Prevzato z Adam, V. et.al. Phytochelatin
modified electrode surface as a sensitive heavy
metal ions biosensor. Sensors. 2005, 5, 70-84.
6
39
CÍLE PRÁCE

1. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
   biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
2. Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat
   pro detekci kadmia a zinku
3. Využít kovy vázající protein metalothionein jako
   další biologickou složku biosensoru
4. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
   aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
5. Studovat interakci cisplatiny s DNA

7
40
I. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
Konstrukce biosensoru
Prevzato z Adam, V. et.al. Phytochelatin
modified electrode surface as a sensitive heavy
metal ions biosensor. Sensors. 2005, 5, 70-84.
8
41
II. Fytochelatinem modifikovanou elektrodu
aplikovat pro detekci kadmia a zinku
Stanovení zinku a kadmia pomocí navrženého
biosensoru
1 mM PC2 60 mM Cd(II)
KADMIUM
PC2(Cd)
1 mM PC2 bez Cd(II)
PC2
l, u Výška píku (nA)
p Výška píku (pA)
CdPC2
0.5 nA
CdPC2
PC2
PC2(Cd)
1.2 0.9 0.6
0.3
Koncentrace kadmia (mM)
Potenciál (V)
ZINEK
1 mM PC2 bez Zn(II)
PC2
1 mM PC2 500 mM Zn(II)
PC2
p Výška píku (nA)
u Výška píku (pA)
ZnPC2
0.5 nA
ZnPC2
1.2 0.9 0.6
0.3
Potenciál (V)
Koncentrace zinku (mM)
Prevzato z Adam, V. et.al. Phytochelatin
modified electrode surface as a sensitive heavy
metal ions biosensor. Sensors. 2005, 5, 70-84.
9
42
CÍLE PRÁCE

1. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
   biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
2. Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat
   pro detekci kadmia a zinku
3. Využít kovy vázající protein metalothionein jako
   další biologickou složku biosensoru
4. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
   aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
5. Studovat interakci cisplatiny s DNA

10
43
III. Využít kovy vázající protein metalothionein
jako další biologickou složku biosensoru
Metalothionein protein

• Intracelulární, nízkomolekulární, na cystein
  velmi bohatý protein (6 10 kDa).
• Metallothionein se skládá ze dvou vazebných domén
  a a ß.
• N-terminální cást peptidu ß-doména tri vazebná
  místa pro dvojmocné ionty.
• C-terminální cást peptidu ?-doména ctyri
  vazebná místa pro dvojmocné ionty kovu.
• Nejcastejší repetice cystein(C)serin(S)cystein(
  C).

(C cystein, S serin, K lysin, G glycin, A
alanin, T threonin, N asparagin, E
kyselina glutamová, M methionin, P prolin, D
kyselina asparagová, Q glutamin, I
isoleucin)
Prevzato z Cobine, M.A. et.al. Solution
structure of Cu6 metallothionein from the fungus
Neurospora crassa. Eur. J. Biochem. 2004, 271,
4213-4221.
11
44
III. Využít kovy vázající protein metalothionein
jako další biologickou složku biosensoru
Modifikace elektrody
Prevzato z Adam, V. et.al. Study of
metallothionein modified electrode surface
behaviour. Electroanalysis. 2005, 17, 1649-1657.
12
45
III. Využít kovy vázající protein metalothionein
jako další biologickou složku biosensoru
Modifikace elektrody
Voltamogramy MT
Adsorpce MT
10 mM MT bez 1 mM TCEP
CdT
CdT
10 nA
CdT
scan
MT(Zn)
mM
MT(Cd)
ZnT
mM
ZnT
Výška píku (nA)
nM
1.2 0.9
0.6 0.3
Potenciál (V)
Doba akumulace (s)
1.2 0.9
0.6 0.3
Prevzato z Adam, V. et.al. Study of
metallothionein modified electrode surface
behaviour. Electroanalysis. 2005, 17, 1649-1657.
13
46
III. Využít kovy vázající protein metalothionein
jako další biologickou složku biosensoru
Konstrukce biosensoru
Prevzato z Adam, V. et.al. Study of
metallothionein modified electrode surface
behaviour. Electroanalysis. 2005, 17, 1649-1657.
14
47
CÍLE PRÁCE

1. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
   biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
2. Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat
   pro detekci kadmia a zinku
3. Využít kovy vázající protein metalothionein jako
   další biologickou složku biosensoru
4. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
   aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
5. Studovat interakci cisplatiny s DNA

15
48
IV. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
Vliv težkého kovu na signály MT
KADMIUM
CdT
CdT
Výška píku (nA)
MT(Cd)
MT(Cd)
CdT
CdT
MT(Zn)
Koncentrace kadmia (mM)
ZINEK
CdT
CdT
MT(Zn)
p Výška píku (nA)
l, p Výška píku (nA)
MT(Zn)
ZnT
ZnT
Koncentrace zinku (mM)
Prevzato z Adam, V. et.al. Study of
metallothionein modified electrode surface
behaviour. Electroanalysis. 2005, 17, 1649-1657.
16
49
IV. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
Lidská moc
Lidské krevní sérum
CdT
CdT
CdT
CdT
Výška píku (nA)
Výška píku (nA)
Výška píku (nA)
Výška píku (nA)
Zn
Cd
Cd
Zn
Koncentrace Cd(II) (mM)
Koncentrace Zn(II) (mM)
Koncentrace Zn(II) (mM)
Koncentrace Cd(II) (mM)
Prevzato z Adam, V. et.al. Study of
metallothionein modified electrode surface
behaviour. Electroanalysis. 2005, 17, 1649-1657.
17
50
IV. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
Porovnání MT biosensoru s metodou diferencní
pulsní anodickou rozpouštecí voltametrií pri
detekci Zn(II)
y 1.0229 (0.0296)x 1.7250(1.6699) R2
0.9958
MT Biosensor
Výška signálu MT(Zn) (nA)
Koncentrace Zn(II) (µM)
y 0.9980(0.0174) R2 0.9949
Výška signálu (nA)
Koncentrace Zn(II) (µM)
Diferencní pulsní anodická rozpouštecí voltametrie
Prevzato z Adam, V. et.al. Study of
metallothionein modified electrode surface
behaviour. Electroanalysis. 2005, 17, 1649-1657.
18
51
IV. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
Detekce cisplatiny pomocí navrženého biosensoru
Chlorid sodný (0.5 M)
CdT
10 mM MT 370 mM cisplatiny
PtMT
1.2 0.9 0.6
0.3
Potenciál (V)
CdT
p Výška píku (nA)
? Výška píku (nA)
PtMT
Koncentrace cisplatiny (mM)
Prevzato z Petrlova, J. Potesil, D. Zehnalek,
J. Sures, B. Adam, V. et.al. Cisplatin
electrochemical biosensor. Electrochim. Acta
2006, in press.
19
52
CÍLE PRÁCE

1. Overit možnost modifikace rtutové elektrody
   biologicky aktivním peptidem fytochelatinem
2. Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat
   pro detekci kadmia a zinku
3. Využít kovy vázající protein metalothionein jako
   další biologickou složku biosensoru
4. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu
   aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
5. Studovat interakci cisplatiny s DNA

20
53
V. Studovat interakci cisplatiny s DNA
Tvorba aduktu cisplatiny s DNA
Prevzato z Kartalou, M. Essigmann, J.M.
Recognition of cisplatin adducts by cellular
proteins. Mutat. Res-Fund. Mol. M. 2001, 478,
1-21.
21
54
V. Studovat interakci cisplatiny s DNA
Tvorba aduktu cisplatiny s DNA
100 mM Cl-
4 mM Cl-
Prevzato z Ericson, A. "Model systems for
metal-DNA interactions". Lund, Sweden Lund
University, 1997, pp. 225.
22
55
V. Studovat interakci cisplatiny s DNA
Studium interakce cisplatiny s DNA
Detekce DNA pomocí cyklické voltametrie
DNA bez prídavku cisplatiny
DNA s cisplatinou
Zmena píku G
G pík
a
b
c
scan
Guanin
d
Výška píku (pA)
50 nA
CA pík
1.5 1.0 0.5 0.0
Potenciál (V)
Potenciál (V)
Koncentrace cisplatiny (mM)
24
56
V. Studovat interakci cisplatiny s DNA
Studium interakce cisplatiny s DNA
CdT
CdT
a
Zmena G pík
Výška píku (pA)
Výška píku (nA)
Výška píku ()
Výška píku (nA)
Koncentrace Pt(II)-DNA aduktu (µg/mL)
Cas interakce (min)
Koncentrace Pt(II)-DNA aduktu (µg/mL)
25
57
Praktické aplikace Mikroorganismy
58
Cíle

• 1. Automatizovaná izolace bakterií S. aureus
• 2. Automatizovaná izolace zinkových proteinu S.
  aureus
• 3. Elektrochemické stanovení zinku z
  bakteriálních proteinu
• 4. Elektroforéza SDS - PAGE

59
Príprava mikroorganismu, základní charakteristika
rustu pri interakci se zinecnatými ionty

• Staphylococcus aureus
• Preockování
• Kultivace 37 C, zákal 0,1 ?600nm
• Prídavek ZnCl2, ZnSO4, Zn(NO3)2
• Fotometrické merení rustových krivek
• (? 600nm)

60
Automatická izolace bakteriálních bunek a
zinkových proteinu pomocí MPs

• Fáze ?. Izolace bakterií Staphylococus aureus
  pomocí MPs modifikovaných IgG
• Fáze ??. Uvolnení proteinu z bakterií S. aureus,
  které se navázaly na povrch MPs pomocí ultrazvuku
• Fáze ???. Následná izolace Zn proteinu pomocí
  MPs s navázanými IgY proti Zn

Zn protein puvodem z S. aureus
61
Výsledky
Overení imobilizace IgG na MPs
Overení imobilizace IgY na MPs
Kalibracní krivka zinku
bez MPs s MPs po MPs
Rust bunek S. aureus MPs
Stanovení zinku v bunkách S. aureus
270.0 200.0 130.0 72.0 30.0 3.0 0.7
0.0 (pocet bunek103)
62
Elektroforetická detekce mikrobiálních proteinu
Overení izolace proteinu pomocí MPs z lyzátu
kDa Mr 67.0 50.0 34.0
17.0 8.0 0.8 0.1
0 .0 (pocet bunek103)
250 150 100 75 50 37 25 20 15
R retentát L bakteriální lyzát
Bilance zinku
Western blotting pomocí sekundární protilátky
Velká podjednotka slepicí
IgY Fab fragment Malá podjednotka
slepicí IgY
63
Záver

• Podarilo se nám vyvinout rychlou a
  automatizovanou metodu pro izolaci bakterií a
  izolaci zinkových proteinu uvolnených z techto
  bakterií.
• Pomocí paramagnetických mikrocástic dokážeme
  izolovat S. aureus v množství menším, než 100
  bunek v 1 ml vzorku.
• Imunoextrakce zinkových proteinu z izolovaných
  bakterií s výtežkem dostatecným pro proteomickou
  analýzu.
• Do budoucna proteomická analýza bakteriálních
  proteinu, které zpusobují jejich rezistenci.

64
Shrnutí
Miniaturizace Osobní prístroje Nízká cena
65

• Literatura
• http//www.elektrochemia.sk/
• A.J. Bard, L.R. Faulkner Electrochemical
  Methods, John Wiley and Sons, New York 1980
• J. Zýka a kolektív Analytická prírucka, I. díl,
  SNTL/ALFA, Praha 1979
• Z. Galus Teoreticeskije osnovy
  elektrochimiceskogo analiza, Izd. Mir, Moskva
  1974
• P. Skladal, Biosensory, Brno, 2002
• J. Wang Analytical Electrochemistry, VCH Publ.,
  New York 1994

66
Dekuji vám za vaši pozornost a preji vám krásný
zbytek dne