Invalidation du g

1
Invalidation du gène Tph1 chez la souris
Rôle de la sérotonine circulante et implication
de la sérotonine maternelle dans la fonction
cardiaque.
Cécile FLIGNY 14 JUIN 2007
2
La découverte de la sérotonine

• Erspamer Vialli, 1937
• Une substance isolée de la muqueuse gastrique
  provoque des contractions des muscles lisses
  elle est nommée entéramine.
• Rapport et coll., 1948
• Une substance présente dans le sang provoque la
  contraction des vaisseaux elle est appelée
  sérotonine.
• Erspamer Asero, 1952
• Entéramine et sérotonine sont une seule et même
  substance.

• Twarog Page, 1954
• La sérotonine est un neurotransmetteur dans le
  cerveau des mollusques et est présente dans le
  cerveau des mammifères.

3
La sérotonine fonctions biologiques

• Système nerveux central

• thermorégulation
• nociception
• mémoire et apprentissage
• cycle veille/sommeil

• comportement sexuel/maternel
• prise alimentaire
• humeur

4
La sérotonine pathologies associées

• Système nerveux central

• schizophrénie
• douleur
• anxiété
• dépression

• comportements suicidaires
• agressivité
• migraine
• alcoolisme

5
Les acteurs du système 5-HT1/ des récepteurs
spécifiques

• 15 récepteurs 5-HT différents, répartis en 7
  classes.

• Récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés
  aux protéines G, à lexception du récepteur 5-HT3.

• Expression dépendante de lorgane et de lespèce
  considérés.

5-HT
Na
R.à 7 domaines transmembranaires
R. canaux (5-HT3)
Na
Signalisation intracellulaire
6
Les acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes
dinactivation
Na
R. canaux (5-HT3)
R. à 7 domaines transmembranaires
Na
Signalisation intracellulaire
7
Les acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes
dinactivation
8
Les acteurs du système 5-HT3/ une enzyme de
synthèse limitante la TPH

• Enzyme limitante de la voie de biosynthèse de la
  5-HT

tryptophane
5-hydroxytryptophane 5-HTP
Décarboxylase des aa aromatiques
5-hydroxytryptamine SÉROTONINE
9
Inactivation du gène Tph chez la souris

• Stratégie de  knock-in 

10
Deux gènes Tph
11
Lieux dexpression des gènes Tph
12
Temps dexpression des gènes Tph
4.5
6.5
8.5
10.5
12.5
14.5
16.5
18.5
0.5
2.5
Naissance

• glande pinéale

• SNC

• intestins

13
En résumé
parents
Souris viables
100 de survie
adultes
14
Conséquences du faible taux de 5-HT circulante?
15
La cathéterisation de conductance
Courbe de fonction ventriculaire gauche
contractilité
Pression
éjection
contraction
relaxation
remplissage
Volume
16
Le phénotype cardiaque est hétérogène
Tph1/
Tph1-/-

• Phase de compensation

Souris 273
17
Le phénotype cardiaque est hétérogène
18
Conclusion (1)
parents
Diminution contractilité cardiaque Insuffisance
cardiaque
Souris viables
100 de survie
adultes
Hétérogénéité importante
19
Origine de lhétérogénéité du phénotype cardiaque?

• Le stress, un facteur aggravant de la
  cardiopathie?
• exacerbation du phénotype cardiaque en période
  de stress

• Le taux individuel de 5-HT, prédicateur de la
  sévérité du phénotype cardiaque?

20
Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie?

• Protocoles envisageables
• Exercice physique (marche forcée, nage).
• Une stimulation adrénergique.

• Protocole expérimental choisi
• Test pharmacologique deffort avec la dobutamine.

Inotrope (? force de contraction) Bathmotrope
(? conduction) Chronotrope (? fréquence)
Catécholamine de synthèse Agoniste ?1-adrénergique
dobutamine
21
Aucune réserve contractile cardiaque
Souris Tph1-/- Non sensibles
Souris Tph1-/- sensibles
22
Modification de la signalisation 5-HT cardiaque

• Étude de liaison des récepteurs ?-adrénergiques
  cardiaques

Tph1/ Tph1-/-
Kd (nmol/l) 0.03 0.00 0.045 0.02
Bmax (fmol/mg prot.) 39.66 2.24 42.42 3.08
ß1/ß 2 () 51 49 52 48
Ø modification de la signalisation ?-AR.
Tph1/ Tph1-/-
5-HT2A (fmol/mg prot.) 67 51
5-HT2B (fmol/mg prot.) 107 211
SERT (fmol/mg prot.) 13 57
23
Conclusion (2)
parents
Absence de réserve contractile cardiaque
Souris viables
100 de survie
stress, facteur aggravant de la cardiopathie
adultes
5-HT2B
SERT
Hétérogénéité importante

• Diminution contractilité cardiaque
• Insuffisance cardiaque

24
Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la
cardiopathie?

• Protocole expérimental
• Mesure des paramètres cardiaques de chaque animal
  par échocardiographie.
• Détermination des taux individuels de sérotonine
  circulante.

• Contrainte
• Analyser un nombre important danimaux .

• Générer un nombre important danimaux mutés dans
  une même portée
• Diminuer lhétérogénéité entre les individus
  dune même portée.

25
Seuls 20 des souris Tph1-/-(-/-) survivent !
parents
Souris viables
Très peu de naissance
100 de survie
adultes
5-HT2B
SERT
20 de survie

• Diminution contractilité cardiaque
• Insuffisance cardiaque
• Stress aggrave la cardiopathie

26
Conséquences du faible taux de 5-HT maternelle?
Génotype maternel Génotype paternel Nombre de croisements Génotype des embryons Génotype des embryons Génotype des embryons dembryons petits / malformés
Génotype maternel Génotype paternel Nombre de croisements / /- -/- dembryons petits / malformés
/ / 3 28 - - 3.6
/ /- 1 4 6 - 0
/ -/- 2 - 27 - 3.7
/- / 1 6 4 - 0
/- /- 4 11 24 10 6.7
/- -/- 2 - 4 3 0
-/- / 3 - 10 80
-/- /- 2 - 9 9 88.9
-/- -/- 2 - - 15 86.7
Embryons normaux
malformations létales à E12
Tph1/(/-)
Tph1/-(-/-)
Tph1/(/)
Tph1-/-(-/-)
La 5-HT maternelle est indispensable pour le
développement embryonnaire normal.
27
Seuls 20 des souris Tph1-/-(-/-) survivent !
parents
Souris viables
Très peu de naissance
100 de survie
adultes
??
5-HT2B
SERT
20 de survie

• Diminution contractilité cardiaque
• Insuffisance cardiaque
• Stress aggrave la cardiopathie

28
Quel phénotype cardiaque?

• Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5
  mois données anatomiques.

Tph1/ Tph1/ Tph1-/-(/-) Tph1-/-(-/-) Tph1-/-(-/-)
2 mois 5 mois 5 mois 2 mois 5 mois
PPVGd (cm) 0.07 0.01 0.07 0.01 0.08 0.01 0.07 0.01 0.06 0.01 ?
PPVGs (cm) 0.10 0.01 0.10 0.01 0.11 0.01 0.10 0.02 0.07 0.01 ? ? ?
Sd (cm) 0.08 0.01 0.08 0.01 0.08 0.01 0.08 0.01 0.07 0.01
Ss (cm) 0.10 0.01 0.10 0.01 0.11 0.01 0.11 0.01 0.08 0.01 ? ?
DIVGd (cm) 0.41 0.01 0.42 0.01 0.41 0.04 0.43 0.05 0.48 0.05 ?
DIVGs (cm) 0.25 0.01 0.25 0.03 0.25 0.05 0.29 0.04 0.35 0.05 ?
Longueur VG (cm) 0.82 0.03 0.80 0.06 0.77 0.07 0.86 0.07 0.84 0.05

• Signes anatomiques de cardiopathie dilatée
  (CMD).
• Se développe entre 2 et 5 mois.

29
Quel phénotype cardiaque?

• Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5
  mois données fonctionnelles.

• Signes fonctionnels de CMD
• ? FS (index de contractilité)

30
Quel phénotype cardiaque?

• Mesure des marqueurs plasmatiques précoces
  dinsuffisance cardiaque.

5 mois
Troponine Ic (ng/ml)
CK-MB (µg/l)

• Augmentation des marqueurs précoces dIC chez
  les Tph1-/-(/-)

Les souris Tph1-/-(/-) développent une
cardiopathie à un âge plus avancé
Influence du génotype maternel
31
Conclusion (3)
parents
Souris viables
Très peu de naissance
100 de survie
20 de survie
adultes
??
5-HT2B
SERT
Cardiopathie dilatée
Augmentation des marqueurs dIC

• Diminution contractilité cardiaque
• Insuffisance cardiaque
• Stress aggrave la cardiopathie

Augmentation des marqueurs dIC
32
La sérotonine circulante

• 90 de la sérotonine circulante est synthétisée
  dans les cellules entérochromaffines par la TPH1.

Neurones myentériques (TPH2)
? 99 plaquettes sanguines
5-HT
Cellules entérochromaffines (TPH1)
? 1 plasma
33
Taux de sérotonine plaquettaire?

• gt 99 de la sérotonine circulante stockée dans
  les plaquettes sanguines.

5 mois
Pas de corrélation entre la sévérité de la
cardiopathie et le taux de 5-HT plaquettaire.
34
Taux de sérotonine plasmatique?

• lt 1 de la sérotonine localisée dans le plasma
  sanguin.

5 mois
35
Corrélation 5-HT / cardiopathie?
corrélation inverse entre la sévérité de la
cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.
36
Conclusion (4)
parents
Souris viables
Très peu de naissance
100 de survie
20 de survie
3-15 20
3-15 41
adultes
5-HT2B
corrélation inverse entre la sévérité de la
cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.
SERT
Tph1-/-(/-)

• Diminution contractilité cardiaque
• Insuffisance cardiaque
• Stress aggrave la cardiopathie
• Augmentation des marqueurs dIC

• Cardiopathie dilatée
• Augmentation des marqueurs dIC

37
Le génotype maternel régule le taux de 5-HT
plasmatique?
2.5
4.5
6.5
8.5
10.5
12.5
14.5
16.5
18.5
0.5
Naissance
38
La 5-HT maternelle régule le taux de 5-HT
plasmatique?

• diminution de la production de 5-HT dans les
  intestins des souris Tph1-/-(-/-)?
• augmentation du catabolisme de la 5-HT?

Peu probable car la concentration plaquettaire de
5-HT est la même entre les groupes de souris
Tph1-/-.

• modification du nombre, de la fonction (capture
  de 5-HT, capacité de dégranulation) et/ou de la
  structure (capacité de stockage de la 5-HT) des
  plaquettes?

39
Les plaquettes sanguines
20

• Nombre de plaquettes sanguines.

5 mois

• Diminution du nombre de plaquettes en fonction du
  génotype maternel .

Plaquettes (103/µl)
40
une première piste?

• Plaquettes sanguines

5-HT2A? 5-HT2B? SERT
5-HT2B SERT
5-HT2A SERT
Réarrangement du cytosquelette
Réarrangement du cytosquelette
5-HT
mégacaryocytes
proplaquettes
plaquettes
41
Limplication des petites protéines G?

• cardiomyocytes adultes

SERT x 5
5-HT2B x 2
5-HT
5-HT
5-HT2B
SERT

• mégacaryocytes

42
Autisme Maladies psychiatriques Diabète Obésite
Études épidémiologiques
Environnement maternel