Title: Invalidation du g
1Invalidation du gène Tph1 chez la souris
Rôle de la sérotonine circulante et implication
de la sérotonine maternelle dans la fonction
cardiaque.
Cécile FLIGNY 14 JUIN 2007
2La découverte de la sérotonine
- Erspamer Vialli, 1937
- Une substance isolée de la muqueuse gastrique
provoque des contractions des muscles lisses
elle est nommée entéramine. - Rapport et coll., 1948
- Une substance présente dans le sang provoque la
contraction des vaisseaux elle est appelée
sérotonine. - Erspamer Asero, 1952
- Entéramine et sérotonine sont une seule et même
substance.
- Twarog Page, 1954
- La sérotonine est un neurotransmetteur dans le
cerveau des mollusques et est présente dans le
cerveau des mammifères.
3La sérotonine fonctions biologiques
- thermorégulation
- nociception
- mémoire et apprentissage
- cycle veille/sommeil
- comportement sexuel/maternel
- prise alimentaire
- humeur
4La sérotonine pathologies associées
- schizophrénie
- douleur
- anxiété
- dépression
- comportements suicidaires
- agressivité
- migraine
- alcoolisme
5Les acteurs du système 5-HT1/ des récepteurs
spécifiques
- 15 récepteurs 5-HT différents, répartis en 7
classes.
- Récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés
aux protéines G, à lexception du récepteur 5-HT3.
- Expression dépendante de lorgane et de lespèce
considérés.
5-HT
Na
R.à 7 domaines transmembranaires
R. canaux (5-HT3)
Na
Signalisation intracellulaire
6Les acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes
dinactivation
Na
R. canaux (5-HT3)
R. à 7 domaines transmembranaires
Na
Signalisation intracellulaire
7Les acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes
dinactivation
8Les acteurs du système 5-HT3/ une enzyme de
synthèse limitante la TPH
- Enzyme limitante de la voie de biosynthèse de la
5-HT
tryptophane
5-hydroxytryptophane 5-HTP
Décarboxylase des aa aromatiques
5-hydroxytryptamine SÉROTONINE
9Inactivation du gène Tph chez la souris
10Deux gènes Tph
11Lieux dexpression des gènes Tph
12Temps dexpression des gènes Tph
4.5
6.5
8.5
10.5
12.5
14.5
16.5
18.5
0.5
2.5
Naissance
13En résumé
parents
Souris viables
100 de survie
adultes
14Conséquences du faible taux de 5-HT circulante?
15La cathéterisation de conductance
Courbe de fonction ventriculaire gauche
contractilité
Pression
éjection
contraction
relaxation
remplissage
Volume
16Le phénotype cardiaque est hétérogène
Tph1/
Tph1-/-
Souris 273
17Le phénotype cardiaque est hétérogène
18Conclusion (1)
parents
Diminution contractilité cardiaque Insuffisance
cardiaque
Souris viables
100 de survie
adultes
Hétérogénéité importante
19Origine de lhétérogénéité du phénotype cardiaque?
- Le stress, un facteur aggravant de la
cardiopathie? - exacerbation du phénotype cardiaque en période
de stress
- Le taux individuel de 5-HT, prédicateur de la
sévérité du phénotype cardiaque?
20Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie?
- Protocoles envisageables
- Exercice physique (marche forcée, nage).
- Une stimulation adrénergique.
- Protocole expérimental choisi
- Test pharmacologique deffort avec la dobutamine.
Inotrope (? force de contraction) Bathmotrope
(? conduction) Chronotrope (? fréquence)
Catécholamine de synthèse Agoniste ?1-adrénergique
dobutamine
21Aucune réserve contractile cardiaque
Souris Tph1-/- Non sensibles
Souris Tph1-/- sensibles
22Modification de la signalisation 5-HT cardiaque
- Étude de liaison des récepteurs ?-adrénergiques
cardiaques
Tph1/ Tph1-/-
Kd (nmol/l) 0.03 0.00 0.045 0.02
Bmax (fmol/mg prot.) 39.66 2.24 42.42 3.08
ß1/ß 2 () 51 49 52 48
Ø modification de la signalisation ?-AR.
Tph1/ Tph1-/-
5-HT2A (fmol/mg prot.) 67 51
5-HT2B (fmol/mg prot.) 107 211
SERT (fmol/mg prot.) 13 57
23Conclusion (2)
parents
Absence de réserve contractile cardiaque
Souris viables
100 de survie
stress, facteur aggravant de la cardiopathie
adultes
5-HT2B
SERT
Hétérogénéité importante
- Diminution contractilité cardiaque
- Insuffisance cardiaque
24Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la
cardiopathie?
- Protocole expérimental
- Mesure des paramètres cardiaques de chaque animal
par échocardiographie. - Détermination des taux individuels de sérotonine
circulante.
- Contrainte
- Analyser un nombre important danimaux .
- Générer un nombre important danimaux mutés dans
une même portée - Diminuer lhétérogénéité entre les individus
dune même portée.
25Seuls 20 des souris Tph1-/-(-/-) survivent !
parents
Souris viables
Très peu de naissance
100 de survie
adultes
5-HT2B
SERT
20 de survie
- Diminution contractilité cardiaque
- Insuffisance cardiaque
- Stress aggrave la cardiopathie
26Conséquences du faible taux de 5-HT maternelle?
Génotype maternel Génotype paternel Nombre de croisements Génotype des embryons Génotype des embryons Génotype des embryons dembryons petits / malformés
Génotype maternel Génotype paternel Nombre de croisements / /- -/- dembryons petits / malformés
/ / 3 28 - - 3.6
/ /- 1 4 6 - 0
/ -/- 2 - 27 - 3.7
/- / 1 6 4 - 0
/- /- 4 11 24 10 6.7
/- -/- 2 - 4 3 0
-/- / 3 - 10 80
-/- /- 2 - 9 9 88.9
-/- -/- 2 - - 15 86.7
Embryons normaux
malformations létales à E12
Tph1/(/-)
Tph1/-(-/-)
Tph1/(/)
Tph1-/-(-/-)
La 5-HT maternelle est indispensable pour le
développement embryonnaire normal.
27Seuls 20 des souris Tph1-/-(-/-) survivent !
parents
Souris viables
Très peu de naissance
100 de survie
adultes
??
5-HT2B
SERT
20 de survie
- Diminution contractilité cardiaque
- Insuffisance cardiaque
- Stress aggrave la cardiopathie
28Quel phénotype cardiaque?
- Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5
mois données anatomiques.
Tph1/ Tph1/ Tph1-/-(/-) Tph1-/-(-/-) Tph1-/-(-/-)
2 mois 5 mois 5 mois 2 mois 5 mois
PPVGd (cm) 0.07 0.01 0.07 0.01 0.08 0.01 0.07 0.01 0.06 0.01 ?
PPVGs (cm) 0.10 0.01 0.10 0.01 0.11 0.01 0.10 0.02 0.07 0.01 ? ? ?
Sd (cm) 0.08 0.01 0.08 0.01 0.08 0.01 0.08 0.01 0.07 0.01
Ss (cm) 0.10 0.01 0.10 0.01 0.11 0.01 0.11 0.01 0.08 0.01 ? ?
DIVGd (cm) 0.41 0.01 0.42 0.01 0.41 0.04 0.43 0.05 0.48 0.05 ?
DIVGs (cm) 0.25 0.01 0.25 0.03 0.25 0.05 0.29 0.04 0.35 0.05 ?
Longueur VG (cm) 0.82 0.03 0.80 0.06 0.77 0.07 0.86 0.07 0.84 0.05
- Signes anatomiques de cardiopathie dilatée
(CMD). - Se développe entre 2 et 5 mois.
29Quel phénotype cardiaque?
- Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5
mois données fonctionnelles.
- Signes fonctionnels de CMD
- ? FS (index de contractilité)
30Quel phénotype cardiaque?
- Mesure des marqueurs plasmatiques précoces
dinsuffisance cardiaque.
5 mois
Troponine Ic (ng/ml)
CK-MB (µg/l)
- Augmentation des marqueurs précoces dIC chez
les Tph1-/-(/-)
Les souris Tph1-/-(/-) développent une
cardiopathie à un âge plus avancé
Influence du génotype maternel
31Conclusion (3)
parents
Souris viables
Très peu de naissance
100 de survie
20 de survie
adultes
??
5-HT2B
SERT
Cardiopathie dilatée
Augmentation des marqueurs dIC
- Diminution contractilité cardiaque
- Insuffisance cardiaque
- Stress aggrave la cardiopathie
Augmentation des marqueurs dIC
32La sérotonine circulante
- 90 de la sérotonine circulante est synthétisée
dans les cellules entérochromaffines par la TPH1.
Neurones myentériques (TPH2)
? 99 plaquettes sanguines
5-HT
Cellules entérochromaffines (TPH1)
? 1 plasma
33Taux de sérotonine plaquettaire?
- gt 99 de la sérotonine circulante stockée dans
les plaquettes sanguines.
5 mois
Pas de corrélation entre la sévérité de la
cardiopathie et le taux de 5-HT plaquettaire.
34Taux de sérotonine plasmatique?
- lt 1 de la sérotonine localisée dans le plasma
sanguin.
5 mois
35Corrélation 5-HT / cardiopathie?
corrélation inverse entre la sévérité de la
cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.
36Conclusion (4)
parents
Souris viables
Très peu de naissance
100 de survie
20 de survie
3-15 20
3-15 41
adultes
5-HT2B
corrélation inverse entre la sévérité de la
cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.
SERT
Tph1-/-(/-)
- Diminution contractilité cardiaque
- Insuffisance cardiaque
- Stress aggrave la cardiopathie
- Augmentation des marqueurs dIC
- Cardiopathie dilatée
- Augmentation des marqueurs dIC
37Le génotype maternel régule le taux de 5-HT
plasmatique?
2.5
4.5
6.5
8.5
10.5
12.5
14.5
16.5
18.5
0.5
Naissance
38La 5-HT maternelle régule le taux de 5-HT
plasmatique?
- diminution de la production de 5-HT dans les
intestins des souris Tph1-/-(-/-)? - augmentation du catabolisme de la 5-HT?
Peu probable car la concentration plaquettaire de
5-HT est la même entre les groupes de souris
Tph1-/-.
- modification du nombre, de la fonction (capture
de 5-HT, capacité de dégranulation) et/ou de la
structure (capacité de stockage de la 5-HT) des
plaquettes?
39Les plaquettes sanguines
20
- Nombre de plaquettes sanguines.
5 mois
- Diminution du nombre de plaquettes en fonction du
génotype maternel .
Plaquettes (103/µl)
40 une première piste?
5-HT2A? 5-HT2B? SERT
5-HT2B SERT
5-HT2A SERT
Réarrangement du cytosquelette
Réarrangement du cytosquelette
5-HT
mégacaryocytes
proplaquettes
plaquettes
41Limplication des petites protéines G?
SERT x 5
5-HT2B x 2
5-HT
5-HT
5-HT2B
SERT
42Autisme Maladies psychiatriques Diabète Obésite
Études épidémiologiques
Environnement maternel