Microscopy : an art ?

1
Microscopy an art ?

• Nat Rev Mol Cell Biol 2002, 2, 133

2
PLAN

• Introduction
• I - Structure au microscope
• A - La microscopie photonique
• B - La microscopie électronique
• II - Visualisation des molécules dans les
  cellules vivantes
• III - Culture cellulaire
• IV - Fractionnement des cellules et analyse des
  molécules

3
I - Observer les cellules au microscope
4
Introduction

• Théorie cellulaire (Schleiden Schwann 1838)
• Lindustrie des colorants
• Conditions de qualité dune analyse morphologique
• échantillon
• microscope
• Les 4 nombres à connaître
• atome 0,2 nm
• ribosome 20 nm
• bactérie mitochondrie 2 ?
• cellule 20 ?

Matthias Schleiden
5
Fig 9-1

• De la cellule à l'atome
• de X10 en X10

Milimètre (10-3 mètres)
6
Fig 9-1

• De la cellule à l'atome
• de X10 en X10

Micromètre (10-6 mètres)
7
Fig 9-1

• De la cellule à l'atome
• de X10 en X10

Nanomètre (10-9 mètres)
8
Table 9-1

• Grandes découvertes en microscopie phoronique

9
Fig 9-2

• Les résolutions

10
A - La microscopie photonique

• Outil essentiel
• Améliorations
• marquage spécifique
• 3 D
• GFP
• Conditions de qualité
• le microscope
• résolution théorique 0,2 µ
• résolution biologique 0,5 µ
• léchantillon

11
Fig 9-3

• Trajet de la lumière dans un microscope

12
Le microscope optique

• Limite longueur d'onde de la lumière(0,4 ? UV
  0,7 ? IR)

Light path in the microscopeF Focal plane,O
Object (Specimen),Ob Objective,Oc ocular
(eyepiece)
13
Fig 9-4

• Interférences lumineuses

14
Phenomènes de Diffraction aux ouverturesPlus les
2 ouvertures (ou diaphragmes) qui diffractent la
lumière sont rapprochées, plus l'angle de
l'intensité maximale de diffraction est grand et
plus l'ouverture de l'objectif qui collecte la
lumière doit être grande
15
Fig 9-5

• "Effet bord"
• Effets d'interférences observées à fort
  grossissement quand la lumière passe au bord d'un
  objet

16
Fig 9-6

1. Ouverture numérique

17
Bouchon au microscope
ROBERT HOOKE (1635 - 1703) est considéré comme
linventeur du premier microscope utilisable à
deux lentilles
Bouchon
18
VAN LEEUWENHOEK (1630 - 1723)
A. VAN LEEUWENHOEK (1630 - 1723)

• C'est l'histoire d'un drapier hollandais qui,
  sans connaissance scientifique, initia par ses
  observations au microscope la bactériologie et la
  protozoologie.
• Né à Delft (Hollande) en 1632, Anton van
  Leeuwenhoek, est envoyé à Amsterdam en 1648 pour
  y devenir apprenti chez un drapier. Trois ans
  plus tard, il choisit sa ville natale pour y
  exercer son métier. Pour apprécier la qualité des
  draps, Leeuwenhoek utilise des perles de verre,
  au pouvoir grossissant limité, mais qui le
  mettent sur la voie du monde microscopique. Au
  fil des ans, il conçoit et réalise de nombreuses
  biconvexes, qui permettent d'obtenir des
  grossissements allant jusqu'à trois cents fois,
  et les emploie à observer tout ce qui lui tombe
  sous la main. C'est ainsi qu'il examine le
  premier les bactéries et les protozoaires
  ("animalcules"), les cellules de la levure de
  bière, les globules rouges et les capillaires
  sanguins. En 1677, il décrit pour la première
  fois les spermatozoïdes chez les insectes, le
  chien et l'homme. Ses travaux sur le cycle de vie
  de différents animaux, notamment des insectes,
  l'amènent à s'opposer à la théorie de la
  génération spontanée. Il montre ainsi comment les
  fourmis passent par différentes phases lors de
  leur développement (œuf, larve et pupe) et prouve
  que les mouches ne naissent pas du sable ou de la
  poussière mais bien de minuscules œufs.
• A partir de 1673, Leeuwenhoek entame une
  correspondance avec la Royal Society de Londres,
  dont il deviendra membre en 1680. Les nombreuses
  lettres de description qu'il envoie font très
  vite sa réputation à l'étranger. Pierre le Grand
  de Russie et Frédéric II de Prusse lui rendent
  même visite à Delft pour avoir l'occasion de
  contempler le monde de l'infiniment petit à
  travers ses microscopes. D'une insatiable
  curiosité, Leeuwenhoek poursuivra ses
  observations jusqu'au dernier jour de sa vie, à
  près de quatre-vingt dix ans.

19
Orci,L2002p133

• Drawing by Marcello Malpighi (1628-1694) anatome
  plantarum

20
MO 1670 XIXème

• De 1670 au XIXème siècle

21
Pacini Circa 1845
22
MO 1903 1904
23
Leitz Photo 1910
24
Orci,L2002p133

• Drawing by Ramon y Cajal (1852-1934)

25
Leitz inversé 1950Nikon diaphot 1985
26
La microscopie photonique

• Contraste de phase
• Fond noir

27
Fig 9-7 Contraste de phase principe

1. On modifie l'amplitude (coloration)
2. On modifie la phase

• Les deux procédés d'obtention de contraste en MO

28
Contraste de phase schéma
29
Darkfield microscope

• Microscope à fond noir

30
La microscopie photonique

• Contraste de phase
• Fond noir
• Contraste interférentiel

31
Polarizing and Interference Contrast Microscopy

• Microscope à lumière polarisée

Amidon de pomme de terre en lumière polarisée
32
Path of light rays within an interference
contrast microscope
Le prisme de Wollaston clive les faisceaux
lumineux. Les cercles et les lignes montrent la
direction de la polarisation des faisceaux
respectifs. (crédit photographique de CARL ZEISS)
33
Differential Interference Contrast(DIC)

• Microscope à contraste interférentiel
• (Polarisation contraste interférentiel)

Differential Interference Contrast
34
Ovocyte en lumière blanche
Lumière blanche
35
Ovocyte en Hoffman
Hoffman
36
Culture cellulaire en Lumière blanche et en
Hoffman
Lumière blanche
Hoffman
37
Fig 9-8

• 4 types de microscopie photonique

38
La microscopie photonique

• Contraste de phase
• Fond noir
• Contraste interférentiel
• Traitement informatique de l'image

39
Fig 9-9 MT
Microtubules
On peut voir UN microtubule en optique
Contraste interférentiel différentiel
La même image traîtée

• Microtubules On peut voir UN microtubule en
  optique

40
Background subtraction
Background subtraction
41
Cardullo,RA2001Encyclopedia Nature(fig1).gif
42
Cardullo,RA2001EncyclopediaNature(fig2).gif
43
Tube séminifère
44
Tête de mouche
45
Capillaires sinusoïdes et hépatocytes
46
Spermatozoïdes
47
La microscopie photonique

• Contraste de phase (fond noir)
• Contraste interférentiel
• Traitement informatique de l'image
• Conditions de qualité
• le microscope résolution 0,5 µ
• léchantillon fixation, inclusion, coupe,
  étalement, coloration. Congélation
• Histochimie, immuno-histochimie,
  histo-enzymologie, autohistoradiographie,

48
Fig 9-10
49
Fixation

• Formol
• Bouin

50
Inclusion

• Paraffine
• Celloïdine

51
Coupe
52
Microtome
53
Ruban de paraffine
54
Étalement
55
Coloration
56
Colorants

• Naturels
• Vert de Malachite
• Noir Soudan
• Safran
• Orcéine
• Éosine
• Aniline
• Hematoxyline
• Synthétique
• Giemsa
• /...

57
Coloration

• Bichromes
• Trichromes
• Hémalun (noyau) éosine (cytoplasme) safran
  (conjonctif)
• Trichrome de Masson

58
Congélation
59
Cryostat
60
Peau HPS
61
Fig 9-11

• Tubule collecteur du rein (HE)

62
Racine HE
63
La microscopie photonique

• Conditions de qualité
• le microscope résolution 0,5 µ
• léchantillon fixation, inclusion,coupe,
  étalement, coloration. Congélation
• Histochimie, immuno-histochimie, histo-enzymologie

64
La microscopie photonique

• Conditions de qualité
• le microscope résolution 0,5 µ
• léchantillon fixation, inclusion,coupe,
  étalement, coloration. Congélation
• Histochimie, immuno-histochimie,
  histo-enzymologie
• Fluorescence

65
Principe de la microscopie à fluorescence
Principe de la microscopie à fluorescence
66
Fig 9-12
67
Deux exemples de fluorochromes fluorescéine et
rhodamine
Bleu ? Vert
Vert ? Rouge
68
Fluorochromes pouvant être excités par une lampe
au mercure
69
Fig 9-13

• Colorants fluorescents
• Il y a toujours allongement de ?
• GFP protéine fluorescente (pas un fluorochrome)
• DAPI ? ADN

70
Fig 9-14

• Cellule en mitose

71
NatureRevMolCellBiol20012(1)Cover.jpg
72
Tubuline Actine DNA en fluo
73
Cellule entière en 3 couleurs
Fluorescence in-situ hybridization (FISH)
74
Mitose en 3 couleurs
75
Fig 9-15
ME (microtubules et filaments)
IF (microtubules)
76
Fig 9-16

• Immuno cytochimie indirecte

Amplification par un AC secondaire
Anticorps poly- ou mono- clonaux
77
La microscopie photonique

• Conditions de qualité
• le microscope résolution 0,5 µ
• l échantillon fixation, inclusion,coupe,
  étalement, coloration. Congélation
• Histochimie, immuno-histochimie,histo-enzymologie
• Fluorescence
• Reconstruction 3-D

78
Reconstruction 3-D

• Coupes optiques (comme pour un scanner en radio)
• Déconvolution d'image

79
Fig 9-17
Après déconvolution
Avant déconvolution
5 ?m

• Chromosome polytène de drosophile après
  déconvolution d'image en microscopie optique

80
Déconvolution d'image
81
Déconvolution d'image
Aberrant mitotic division of vertebrate cell
infected with the medically important protozoan
parasite, Toxoplasma gondii.
Raw Image
Deblurred Image
82
Déconvolution d'image
Cross section of hematoxlin and eosin stained
muscle cell infected with Trypanosoma cruzi, the
causative agent of Chagas' disease in man
Raw Image
Deblurred Image
83
Déconvolution d'image
The sample shown above is a pure phase object,
whose data were obtained by brightfield
microscopy. No stain was used. The natural
refractive index inhomogeneity is the mode of
contrast (i.e., a pure phase object). The
condenser iris diaphram was stepped down slightly
to improve the contrast of the phase object
Raw Image
Deblurred Image
84
Déconvolution d'image
PtK1 cell with antibody staining for microtubules
(green) and DNA (blue)
85
La microscopie photonique

• Conditions de qualité
• le microscope résolution 0,5 µ
• l échantillon fixation, inclusion,coupe,
  étalement, coloration. Congélation
• Histochimie, immuno-histochimie,histo-enzymologie
• Fluorescence
• Reconstruction 3-D
• Confocal

86
Fig 9-18

• Microscope confocal à fluorescence

87
Fig 9-18

• Microscope confocal à fluorescence

88
La microscopie photonique

• Conditions de qualité
• Fluorescence
• Reconstruction 3-D
• Confocal

89
Confocal principe
90
Confocal principe
91
Confocal principe
92
Fig 9-19

• Embryon de drosophile

93
Neurone en confocal
94
Neurones en confocal
Neurones en confocal
95
Embryon de drosophile.Site de Leica image gallery
Embryon de drosophile
96
Fig 9-20 (A)

• Reconstruction 3-D d'un grain de pollen

97
Fig 9-20 (B)

• Queue d'embryon de poisson zèbre

98
Grain de pollen de tournesol
99
Fluid-filled polymer microcapsule
100
Mouse muscle, fluorescently labeled to highlight
sites that are contacted by a motor neuron
101
Active neurons

• ACTIVE NEURONS (colored bodies) are highlighted
  in this slice of rodent brain tissue that was
  kept alive artifcially. The picture is a
  computer-generated compilation of three confocal
  images made 12 seconds apart by Michael E. Dailey
  and Stephen J Smith of Stanford University. Each
  time point was coded by a single colorÑÞrst red,
  then green and then blue. The image thus reveals
  that neurons Þred at different times and that
  some of them were active during two of the shots
  (such as the yellow cell ) or during all three
  (white).

102
La microscopie photonique

• Conditions de qualité
• le microscope résolution 0,5 µ
• l échantillon fixation, inclusion,coupe,
  étalement, coloration. Congélation
• Histochimie, immuno-histochimie,histo-enzymologie
• Fluorescence
• Contraste de phase
• Contraste interférentiel
• Confocal
• Informatique confocal

103
Confocal 3DPortraits of pollen grains

• A computer digitized the images, or optical
  sections, and combined them
• Such digital reconstructions can be viewed in any
  orientation

PORTRAITS OF POLLEN GRAINS
104
Confocal 3DPortraits of pollen grains

• A computer digitized the images, or optical
  sections, and combined them
• Such digital reconstructions can be viewed in any
  orientation

PORTRAITS OF POLLEN GRAINS
105
Confocal 3D portrait of neurone

• THREE-DIMENSIONAL RECONSTRUCTION of a neuron
  stars in this Þlmstrip in each successive frame
  the structure is rotated some 10 degrees around
  the vertical axis. The strip yields a movie of
  the rotating cell. To view the neuron in three
  dimensions, cross your eyes as you look at a pair
  of images, focusing each eye on a different frame.

106
Confocal industrie