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Eduardo João Pereira Junior
Técnicas Citoquímicas Aplicadas à Embriologia
Vegetal
Disciplina Elementos de Microscopia e
Microanálise Docente Profa. Dra. Maria Tercília
V. de Azeredo Oliveira
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? FLOR Ramo modificado que porta os esporófilos
(carpelos e estames) ? ANDROCEU (estames)
filete(1) conectivo(3) antera bilobada(2) ? 4
androsporângios ou sacos polínicos(4) ?
GINECEU estigma(1) estilete(2) ovário(3) com
óvulos (4), (5- saco embrionário)
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? ANDROSPOROGÊNESE E ANDROGAMETOGÊNESE ?
Androsporogênese ? formação dos andrósporos
dentro dos androsporângios ?
androgametogênese ? desenvolvimento do andrósporo
em um grão de pólen
Lilium
Lilium
4
? GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
? Ginogametogênese ? formação do ginósporo no
interior do nucelo (ginosporângio)
Tabebuia pulcherrima
5
? GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
Lilium
6
? GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE
? Ginosporogênese ? desenvolvimento do ginósporo
em um ginófito (saco embrionário)
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? FERTILIZAÇÃO
8
h
sd
9
Arabidopsis
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Técnicas Citoquímicas
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? Calose Solução de azul de anilina ? Cora
tecidos frescos ou fixados (10-15 min.) ?
Elevando-se o pH para 9 ou 10 aumenta a
intensidade da coloração mas diminui sua
aplicabilidade como corante vital ? Resultado A
calose emite fluorescência verde/amarela ao ser
observada em microscopia de epi-fluorescência com
comprimento de onda da luz UV em 365 nm.
Azul de anilina
0,005 K2HPO4

0,15M pH
8,2
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? Polissacarídeos insolúveis PAS ? Ótimo
protocolo de coloração para identificar
polissacarídeos insolúveis ? Utilizado para
secções frescas, secções desparafinizadas,
secções incluídas em glicol metacrilato ou epóxi.
? Grupos aldeídicos do tecido (principalmente se
houve fixação com um aldeído) devem ser tratado
com um agente bloqueador, p.ex. solução saturada
de 2,4-dinitrofenil hidrazina em ácido acético
15 durante 30 min ? Lavar por 30 min. em água
corrente ? Oxidar por 10 min. em ácido periódico
1 ? Lavar rapidamente ? Corar com reativo de
Shiff ? Resultado polissacarídeos se coram de
púrpura, os núcleos podem se corar fracamente
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? Lignina Floroglucinol ? Usado freqüentemente
com cortes á mão livre ? Gotejar uma a solução de
floroglucinol sobre o tecido e incubar por 30
60 min ? Resultado células lignificadas se
coram de vermelho. A coloração não é permanente,
o corante se degrada num curto período.
Etanol
100 mL HCl
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mL Floroglucinol
0,1 g
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? Amido IKI (Iodo-Iodeto de Potássio) ? Usado
em cortes manuais ou incluídos ? Gotejar uma gota
de IKI sobre o tecido e deixar reagindo por 5
min. ? Resultado O corante se intercala na
estrutura do amido resultando numa coloração
escura.
Água destilada
100ml Iodeto de Potássio
1 g Iodo
1 g
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? Ácidos graxos, suberina e cutina Sudan ? Cora
cortes frescos e secções incluídas em
historresina ? Coloca-se o corte em etanol
50 por poucos segundos, então adiciona-se o
corante ? Incuba-se por 5 10 min. com o
corante, que dever ser recém preparado ?
Mergulha-se novamente em etanol 50 ? Montar em
glicerina
Etanol 70
100 mL Sudan IV, Sudan Black
0,07 g
? Resultado Os lipídios bem como a suberina e a
cutina solubilizam o corante e torna-se
distinguíveis. Sudan Black B pode ser usado para
corar ceras fracamente
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? Pectina Vermelho de Rutênio ? Usado para
tecidos fixados ou frescos ? As secções são
mergulhadas numa solução preparada imediatamente
antes do uso com de vermelho de rutênio a
0,005 ? Os tecidos são montados em uma solução
de glicerina dissolvida ? Resultado as
substâncias pectínicas (lamela média) se coram de
vermelho ou rosa.
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? Clarificação de tecidos (Fluido de Herr)
Microscopia de Normanski ? Método indicado para
visualizar células e tecidos delicados como
óvulos e embriões intactos dentro dos
óvulos/sementes em estádios iniciais ? Fixar o
material em fluido de Navashin modificado por
Randolph ?Dissecar (p. ex.) os ovário e
mergulhá-los no fluido de Herr por pelo menos 24
horas ? Montagem coloque o material sobre uma
lâmina escavada com um pouco da solução de
clarificação ? Cobrir com lamínula e observar em
microscopia de contraste interferencial de
Normanski
Ácido Lático
20g Cloral Hidratado
20g Fenol
20g Óleo
de Cravo
20g Xilol
20g
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(No Transcript)
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? DNA 4-6- Diamino-2-fenilindol (DAPI) ?
Dissecção e fixação do tecido por 24 horas em
solução de álcool etílico e ácido acético (31).
? Em seguida as peças são infiltradas em
historesina e seccionadas em série em micrótomo
? As secções aderidas em lâminas de vidro são
imersas em solução de 0,25 mg/ml-1 de 4,
6-diamidino-2- fenilindol (DAPI), em tampão TRIS
0,05 M, e mantidas na temperatura ambiente e no
escuro ? Em seguida, as secções são examinadas
em microscópio de epi-fluorescência ?
Resultado Núcleos emitem fluorescência azul
20
nps
ns
nce
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no
o
sp
21
Obrigado !