PowerPoint-Pr

1
V13 Proteinfaltung
Es gibt zwei grundsätzliche Sichtweisen des
Proteinfaltungsproblems 1 Was sind die
treibenden Kräfte (driving forces), aufgrund
derer sich ein Protein faltet? Physikalische/bio
informatische Sicht des Problems. 2 Zu welcher
dreidimensionalen Struktur faltet sich
(m)ein bestimmtes Protein? Biologische Sicht
des Problems.
2
Modellproblem Kollision von H mit H2
Reaktion kann durch eine Reaktionskoordinate kompl
ett beschrieben werden.
Dobson, Karplus, Angew. Chemie Int. Ed. 37, 868
(1998)
3
experimentell beobachtbare Variablen

• Die komplette Beschreibung der Protein-faltungsrea
  ktion erfordert eine Vielzahl an
• Reaktionskoordinaten
• - Wie ändert sich die Größe (der radius of
• gyration) mit der Zeit?
• (Exp. Kleinwinkelstreuung)
• Wann bilden sich Elemente der Sekundärstruktur?
• (Exp. FTIR, CD)
• Wann bildet sich der hydrophobe Kern?
• (Exp. Fluoreszenz)
• Wann werden die Wassermoleküle aus
• dem Proteininneren verdrängt?
• (Fluoreszenz-Quenching)
• Wann sind welche tertiären Kontakte
• gebildet? (siehe ?-value analysis, NMR)
• Was ist die Rolle von Dynamik
• (H/D-Austausch-Experimente)
• - Gibt es Intermediate?

Dobson, Karplus, Angew. Chemie Int. Ed. 37, 868
(1998)
4
Proteinfaltung Kombination von Simulation mit
Experiment notwendig
Experimente zeigen die Faltung stets entlang
einiger weniger Reaktionskoordinaten. Es ist
schwierig, dadurch den Mechanismus der
Proteinfaltung zu verstehen. Das Fazit dieser
Stunde wird lauten Reichen Simulationen
allein aus um Proteinfaltung zu verstehen?
Nein! Kombination von Simulation mit
Experiment. Ja!
5
driving forces für Proteinfaltung
1 Typen von Wechselwirkungen hydrophob elektrost
atisch 2 Wechselwirkungspartner Protein-Protein
Protein-Solvens Solvens-Solvens 3 Freie
Enthalpie (?G) des Gesamtsystems reduzieren,
nicht z.B. nur die innere Energie des Proteins
alleine ? dynamische Simulationen notwendig
6
Nicht betrachtete Spezialfälle
1 Proteine mit Di-Sulphidbrücken (z.B.
BPTI) Faltungskinetik wird komplett durch
Bildung von Disulfidbrücken dominiert. 2 Proteine
mit cis-Prolinen in entfalteten Peptide sind
Proline zu 10 20 in cis-Konformationgefaltete
Proteine haben fast nur trans-Proline
cis/trans-Isomerisierung dauert jedoch Minuten
es gibt jedoch spezielle cis/trans-Isomerasen
wie Cyclophilin 3 Mehr-Domänenproteine ... Was
bleibt dann noch übrig? kleine Standard
Ein-Domänen-Proteine
7
Warum ist die Energetik der Proteinfaltung ein
schwieriges Problem?
Problem der Proteinfaltung beinhaltet zwei
Aspekte (a) Sequenz ? Struktur ist weitgehend
ungelöst (b) Verständnis der treibenden
Kräfte/Dynamik/ Mechanismen. Diese sind
mittlerweile vergleichsweise gut
bekannt. warum ist (a) so schwierig? Beispiel
Lysozym bei 25? C ?H U?F 2245 kJ/mol
davon sind 1881 kJ/mol von den nichtpolaren
Gruppen und 364 kJ/mol von den polaren
Gruppen - T ?S U?F 2186 kJ/mol ?
U?F 59 kJ/mol d.h. nur ca. 0.4 kJ/mol pro
Residue ! Die Differenz zweier sehr großer Terme
ist selbst sehr klein.
8
Levinthal-Paradox 1968
C. Levinthal, J. Chim. Phys. 65, 44-45
(1968) Falls man eine Kette von 100 Aminosäuren
betrachtet und annimmt, dass jede Aminosäure in
einer von 3 Konformationen existieren kann
ausgestreckt, Helix oder Schleife - dann gibt es
3100 mögliche Weise, die Kette anzuordnen. Das
sind etwa 1048 Konformationen.  Die Rotation um
Bindungen geschieht höchstens 1014 mal pro
Sekunde. Daher dauert eine Zufallssuche nach der
richtigen Konformation etwa 1034s 1026 Jahre,
viel länger als das Alter des Universums! Die
kritische Annahme dabei ist, dass alle möglichen
Konformationen mit der gleichen
Wahrscheinlichkeit gesampelt werden. Der
Faltungstrichter sieht also wie ein Loch auf
einem flachen Golfplatz aus. Daher wurde
vermutet, dass bestimmte Faltungspfade
existieren, die zur gefalteten Struktur führen.
9
Golfkurs-Beispiel
1-D Energielandschaft. Im Fall extremer
Frustration gibt es keine Korrelation zwischen
struktureller Ähnlichkeit mit dem Grundzustand
und der Energie. Einzige MöglichkeitZufallssuch
e.
10
Lösung für Levinthal-Paradoxon Folding Funnel
Energielandschaft eines minimal frustrierten
Heteropolymers. Die Trichterform ermöglicht,
dass der gefaltete Zustand in kurzer Zeit
erreicht wird.
11
Modelle um Proteinfaltung zu beschreiben
Nucleation-condensation-Modell Wetlaufer, D.B.
(1973) PNAS 70, 697 Es werden einige kritische
kinetische Nuklei geformt, um die herum der Rest
der Struktur wächst. Framework Modell Ptitsyn,
O.B. Rashin, A.A. (1975) Biophys. Chem. 3,
1 Zunächst falten sich die Sekundärstrukturelement
e. Diese docken dann im ratenlimitierenden
Schritt zur 3D-Struktur. Modell des hydrophoben
Kollapses Dill, K.A. (1985) Biochemistry 24,
1501 Treibende Kraft ist der hydrophobe Effekt.
Wasser wird unspezifisch verdrängt. Die
abschliessende Umordnung des kollabierten
Zustands ist ratenlimitierend.
12
Nucleation-condensation Modell
Die ersten Schritte der Proteinfaltung sind
entropisch ungünstig, durch den Verlust an
Entropie aufgrund der reduzierten Beweglichkeit
der Seitenketten. Der enthalpische Gewinn durch
entstehende native Wechselwirkungen kann dies
nicht ganz kompensieren. Erst im
Übergangszustand (transition state) werden die
beiden Beiträge gleichgroß. Danach geht die
Faltung downhill.
13
Framework-Modell
gewann an Bedeutung als man kleine
Sekundärstrukturelemente-Fragmente von Proteinen
identifizieren konnte, die bereits in Lösung
gefaltet sind. (Munoz, Serrano 1994-1997).
14
Auch native Kontakte passen zum Framework-Modell
native Kontakte native Kontakte sind
essentiell ? Hypothese, daß es kleine
Peptidstücke gibt, unabhängig faltende
Einheiten, sogennante Foldons Beispiele
?-hairpins (MunozEaton), die sich in ca. 6 ?s
falten kleine Fragmente aus BPTI
(SYPFDV) Langevin-Simulationen
zeigen ?-Helices falten sich in ca. 10-100
ns ?-hairpins brauchen ca. 10 ?s
a Ar(i)-HN(i) Wechselwirkung zwischen Phe517 und
der Amidgruppe des Rückgrats von Tyr518 in
Phosphoinoitide-Specific Phospholipase C (1DJX).
b Ar(i)-HN(i) Wechselwirkung in Ascorbate
Oxidase (1AOZ). Tóth et al. Proteins 43, 373
(2001)
15
Molten Globule
Modell des hydrophoben Kollapses sagt ein
Faltungs-Intermediat voraus, den sogenannten
Molten Globule, den man kinetisch und im
Gleichgewicht als eine expandierte Form
des gefalteten, nativen Zustands charakterisiert
hat.
16
Neue Methoden
Hydrogen-Exchange H/D-Austausch der Backbone
HN-Atome gegen D/H-Atome der Lösung. Gibt
Information über Faltungs-Intermediate ist diese
Gruppe solvenszugänglich? Konsolidierung des
Protein-Rückgrats. Protein Engineering
(Mutagenese) sensitiv für Seitenketten-Wechselwir
kungen. Entdeckung von kleinen Proteinen mit
lediglich zwei Zuständen (gefaltet ?
entfaltet) CI-2 spectrin SH3 cold shock
protein CspB Bisher wurden etwa 30 Proteine mit
dieser Methode untersucht.
17
Mechanismus der Proteinfaltung (Fersht)
(a) zwei extreme Szenarien Framework bedeutet,
dass sich die 2nd-Strukturelemente zuerst
falten. Nucleation condensation ist ein
Kompromiss zwischen den beiden Extremfällen. (b)
Proteine, die man einer oder der anderen
Kategorie zuordnen kann. Bisher wurde kein
Protein gefunden, das einen reinen Hydrophoben
Kollaps zeigt, also während des Kollapses keine
2nd-Struktur formt.
Daggett, Fersht, TIBS 28, 18 (2003)
18
Faltung kleiner Proteine
Nucleation-condensation wird heute als
Standardmechanismus für die Faltung kleiner
Proteine angesehen (Serrano und Mitarbeiter, PNAS
99, 15846 (2002)). Manche Proteine falten jedoch
auf eine polarisierte Weise, wobei sich ein Teil
der Struktur sehr früh bildet und andere
Abschnitte bis zuletzt unstrukturiert
bleiben. CI-2 2-Zustand global diffusalle
Residuen falten sich gleichzeitig SH3 2-Zustand i
m Übergangszustand ist eine Region des Proteins
fast vollständig gefaltet, eine andere jedoch
nur kaum. Barnase zwei Faltungsmodule falten
sich unabhängig voneinander zu Intermediat
gemäss NC-Mechanismus Dann docken diese beiden
Module gemäss Framework-Modell.
19
New view of Protein folding Faltung auf
rauhen, trichterförmigen Energielandschften
Bryngelson, Wolynes, PNAS (1987) gradient ?
roughness macht Faltung macht
Faltung schneller langsamer Frustration
Brooks, Gruebele, Onuchic, Wolynes, PNAS 95,
11037 (1998)
20
Energielandschaft mit unterschiedlicher
Frustration
Links hoch frustrierte Landschaft mit Tg gt
Tf. Rechts geringe Frustration Tg lt Tf
Ähnlichkeit mit Trichterform
21
Theorie der Energielandschaften für Proteinfaltung

• nach Onuchic, Nymeyer, Garcia, Chahine, Socci,
  Adv. Prot. Chem. 53, 87 (2000)
• http//guara.ucsd.edu/group/Folding-papers.html
• Holy grail Proteinsequenz ? Proteinstruktur
• Entwicklung von theoretischen Konzepten, mit
  denen man sich faltende von sich nicht faltenden
  Sequenzen unterscheiden kann.
• P.S. Kim R.L. Baldwin (Annu Rev BioChem 59, 631
  1990)
• Faltung geschieht entlang von Pfaden mit
  wohldefinierten Intermediaten.
• Diese Sichtweise wurde seit Beginn der 90er
  Jahre durch das Bild der Faltung eines Proteins
  in einem Faltungstrichter der Energie ersetzt.
• Faltung ist ein kollektiver (d.h. die Faltung
  der Aminosäurenkette beginnt an vielen Positionen
  gleichzeitig) und selbst-organisierter Prozeß
• Faltung geschieht entlang einer Vielzahl von
  Routen bis auf den Boden des Faltungstrichters.

22
Rolle der Topologie
D. Baker, Nature 405, 39 (2000) Für viele
Proteine ist die Faltungsgeschwindigkeit durch
das Verhältnis von lokalen zu nicht-lokalen
Kontakten bestimmt.
a bis d. rot grosser Einfluss auf Faltungsrate,
blau kleiner Einfluss. e Kontakt-Ordnung
mittlerer Sequenz-Abstand räumlich benachbarter
Amino-säuren normiert über die Gesamtlänge des
Proteins. f überraschend deutlicher Zusammenhang
zwischen der Faltungsgeschwindigkeit von
Proteinen und ihrer Kontakt-Ordnung.
23
?-value Analyse
Studiere den Effekt von Mutationen auf die
Kinetik und Stabilität der Proteinfaltung. Die
grüne Residue hat im Übergangszustand (TS) fast
die gleiche Umgebung wie im gefalteten Protein
(N). Daher wird TS um den gleichen Betrag
destabilisiert wie N. Umgekehrtes gilt für die
blaue Residue.
kennzeichnet Daten für eine Mutante
Daggett, Fersht, TIBS 28, 18 (2003)
24
Proteinfaltung mit Simulationen

• Faltung von ?-Helices und ?-Faltblättern dauert
  100 ns bis 10 ?s.
• MD-Simulation auf einem Prozessor mit 2 fs
  Zeitschritt würde Jahre dauern.
• verschiedene Auswege aus diesem Dilemma
• Vereinfachung der Proteindarstellung (HP- oder
• Go-Modelle)
• 0 steered Molecular Dynamics Entfaltung unter
  Zwangskraft.
• Problem Freies Energieprofil ist pfadabhängig
  (wird nicht behandelt).
• 1 Simulation der Entfaltung bei erhöhter
  Temperatur
• 2 systematische Variation entlang eines
  Faltungsparameters liefert die
• Hyperfläche der Freien Enthalpie
• 3 distributed computing Faltungskinetik aus
  zahlreichen kurzen Simulationen

25
Entfaltungssimulationen bei erhöhter
Temperatur Faltung von CI2

• Kristallstruktur. (b) Entfaltungssimulation bei
  100 K. Umgekehrte Reihen-
• folge der Schnappschüsse.

S Werte charaktisiert Packungswech-selwirkung
en der Residue und ihrer lokalen 2nd-Struktur. Gu
te Korrelation mit experimentel-len ?-Werten.
Daggett, Fersht, TIBS 28, 18 (2003)
26
Faltung von Barnase
(a) NMR-Struktur von Barnase. (b)
MD-Schnappschüsse von 225C Simulation. (c)
Korrelation von S und ?. Gute Übereinstimmung
bis auf grüne Boxen (?2-Helix). Ihr
helikaler Anteil im TS, aber auch im entfalteten
Zustand ist in MD-Simulation grösser. Eventuell
bedeutet dies, dass die ?-Analyse solch autonom
faltende Einheiten nicht gut beschreiben kann.
Daggett, Fersht, TIBS 28, 18 (2003)
27
MD erlaubt detaillierte Einblicke in
Faltungsprozess
Daggett, Fersht, TIBS 28, 18 (2003)
28
Faltung der engrailed homeodomain
(a) Übergangszustände bei 100C und 225C sind
sehr ähnlich. Erhöhung der Temperatur bewirkt
also vermutlich keine Veränderung des allgemeinen
Faltungs- pfades, sondern beschleunigt lediglich
die Faltung/Entfaltung. (b) Helices sind selbst
im denaturierten Zustand stabil. Die engrailed
homeodomain ist also ein Beispiel für ein
Protein, das gemäss dem Framework-Modell faltet.
Daggett, Fersht, TIBS 28, 18 (2003)
29
Rolle der Topologie
Proteine mit SH3-ähnlicher Struktur. Die
Farbkodierung folgt den ?-Werten blau für kleine
?-Werte, rot für grosse ?-Werte. Je grösser der
?-Wert, desto mehr gefaltet ist die entsprechende
Region in der Region des Übergangszustands. Topo
logie ist nicht alles Die Unterschiede in dem
Faltungsverhalten dieser 3 Proteine lassen sich
nur durch spezifische Wechselwirkungen erklären.
Schymkowitz et al. PNAS 99, 15846 (2002)
30
Faltungssimulation entlang Reaktionskoordinate sr
c-SH3 Domäne
Kristallstruktur 1SRL (a) 6.5 Å contact map
zwischen nicht-benach- barten Residuen für die
Kristallstruktur. (b) contact maps
aus MD-Simulationen für ?0.2 (über
Diagonale) ?0.4 (unter Diagonale) (c) ?0.6
(über Diagonale) ?0.8 (unter Diagonale) ?
entspricht der Anzahl an nativen Kontakten.
Shea, Onuchic, Brooks, PNAS 99, 16064 (2002)
31
Faltung der src-SH3 Domäne
(a) pmf bei 298 K als Funktion der Anzahl nativer
Kontakte Profil zeigt klar downhill. (b) und
(c) Erweiterung von (a) um den Gyrations-Radius
bzw. die Anzahl an Wassermolekülen im Kern. (d)
Überlagerung von 3 Entfaltungssimulationen
bei 400 K. Profile wurde mit einem
Zwangs- potential entlang von ? erzeugt.
Shea, Onuchic, Brooks, PNAS 99, 16064 (2002)
32
Faltungssimulation mit Distributed Computing für
BBA5, ein Designer-Protein

• Das Design des 23-Residuen langen BBA5-Motifs
• (?-Hairpin / turn / ?-Helix) wurde von der
  Faltung
• von Zinkfinger inspiriert.
• NMR-Struktur von BBA5
• Doppelmutante (2.2 Å)
• Doppelmutante (2.4 Å)
• Einzelmutante (2.5 Å)
• BBA5 besitzt starke Tendenz, Sekundärstruktur-
• elemente zu formen und kleinen hydrophoben Kern.
• Daher ist der Effekt von Ungenauigkeiten des
• Kraftfelds vielleicht eher klein.

33
Folding_at_Home
Faltungssimulation von 10 ?s Länge auf einem
Prozessor würde Jahrzehnte dauern, selbst mit
implizitem Solvens. Distributed computing
(Folding_at_home) simuliere 10.000 Simulation von
jeweils 5 - 20 ns Länge mit implizitem
Solvensmodell. Für ein kleines Protein mit einer
Faltungszeit von 10 ?s sollten etwa 10 von 10.000
Simulation innerhalb von 10 ns gefaltet
sein. Folding_at_home 30.000 Heimbenutzer stellten
ihre PCs über Monate zur Verfügung um
MD-Simulationen während idle-Zeit laufen zu
lassen. Die akkumulierte CPU-Zeit entspricht ca.
1 Millionen CPU-Tage! Es wurden über 100
unabhängige Faltungsvorgänge beobachtet.
34
Faltungstrajektorien für Doppelmutante
Ca backbone (blau 1-3 und 6-8, rot 11-21) und
ausgewählte Seiten-ketten (Y1 Y3 Y6 W8 E13 L14
L17 L18) für Faltungstrajektorien, die nahe der
nativen BBA5- Struktur enden (unten). a, 2.2 Å
b, 2.4 Å c, 2.6 Å d, 3.0 Å e, Natives BBA5 f,
Natives BBA1 mit artifizieller Aminosäure Fen in
Orange g, Homologie-Model für Doppelmutante h,
anderes Homologie-Modell.
35
Energie-Landschaft der Faltung
Logarithmierte Population von verschiedenen
Kombinationen aus RMSDca und Gyrations-Radius für
a, 9000 sich faltende Trajektorien nach 1 ns,
die aus einem gestreckten Zustand gestartet
wurden. b, dieselben Trajektorien nach 20ns c,
2500 Simulationen des nativen Zustands nach 10
ns. Nach 20 ns ist das entfaltete Ensemble so
kompakt wie das gefaltete Ensemble (Radius of
Gyration, y-Achse). Es gibt aber nur einen
kleinen Überlapp zwischen b und c Ein kleiner
Teil des gefalteten Ensembles (c) ist nach 10 ns
teilweise entfaltet, und ein kleiner Teil des
entfalteten Ensembles ist nach 20 ns gefaltet (b).
36
Zunahme an Sekundärstruktur in Doppelmutante
(a) Helikale Strukturen (278K). b,
Hairpin-Structuren (278K). c, Präsenz von
mindestens 4 a-helikalen Residuen. d,
Population eines richtigen ß-Hairpins um Residuen
4-5. Native Ensembles sind gezeigt bei 278, 378,
und 478 K ( ?, , und ?). Faltende Ensembles bei
278 und 338 K sind mit ? und ? markiert. Der
entfaltete Zustand ist zu 40 a-helikal.
37
Exp. Faltungs-Thermodynamik und kinetik von BBA5

• CD-Spektra. Die isodichroischen Punkte (rot)
  deuten auf Zwei-Zustands-Modell hin.
• Normalisierte Fluoreszenzspektren.
• Temperatur-Sprung durch 10 ns Laserpuls induziert
  teilweise Entfaltung.
• Zeitaufgelöste Beobachtung der um 11 nm
  rotverschobenen Fluoreszenz.
• Exp. Faltungszeit 7.5 3.5 ?s
• Simulation 6 ?s
• Quantitative Übereinstimmung!

Snow et al. Nature 420, 102 (2002)
38
Zunahme der gefalteten Zustände
Faltung in den Simulationen. Bei höherer
Temperatur geschieht Zunahme ca. 2 mal so schnell.
Snow et al. Nature 420, 102 (2002)
39
Unfolded states and transition states

• Understanding protein folding not only involves
  predicting the folded structures of foldable
  sequences.
• In order to characterize the stability of a
  protein
• need free energy difference between folded and
  unfolded structure
• ? what is the structural ensemble of the
  unfolded state?
• In order to understand kinetics of folding
  process
• need structure of transition state
• Difficult to characterize these structures by
  experiments.
• Simulations are ideal tools.

40
The protein folding network
Transition states for protein folding have native
topologies despite structural variability, Kindorf
f-Larsen, Vendrusculo, Paci Dobson, Nat.
Struct. Biol. 11, 443 (2004)
Michele Vendrusculo
Chris Dobson
Emanuele Paci
41
Structure and sequences of SH3 domains used

• Native state structure of the src SH3 domain
  colored from its N (red) to C terminus (blue).
• Sequence alignment of the three SH3 domains from
  src, Fyn and ?-spectrin. Residues in ?-strands
  are green and those in 310 -helices are blue. The
  nine boxed positions (IIX) are the major
  hydrophobic core residues.

Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
42
Representations of the transition state ensemble
(TSE)
(a) Three members of the TSE traced within an
atomic density map20 calculated from the backbone
atoms of 20 representative structures from the
TSE.
Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
43
Structure and sequences of SH3 domains used
(b) The red (? 500 K) and green (? 640 K)
points show the spread in radius of gyration and
structural diversity in the TSE. The black
points represent the comparable data from the
native state ensemble. Four structures
representative of different regions of the plot
are colored according to the conformational
variability (blue RMS ? 1Å, red RMS gt 8Å
Conformations of central 3-stranded sheet (?2 -
?4) are much less variable than those of ?1 and
?5.
Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
44
Energy maps of native state and TSE of src SH3

• (c) Ensemble-averaged pairwise interaction
  energies between residues in the native state
  (above diagonal) and in the TSE (below diagonal).
  
• Many features found in the native state are also
  found in the TSE
• interactions between (?2 - ?4), in particular
  between ?3 and ?4.
• part of the RT loop packs on to ?4.
• Surprising although strands ?1 and ?5 are
  relatively disordered (previous slide) the
  interactions formed are very similar to those in
  the native state.

Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
45
TSEs of SH3 domains from ?-spectrin and Fyn

• (a,b) TSEs of (a) ?-spectrin SH3 domains and (b )
  Fyn SH3 domains.
• Color coding according to the conformational
  variability as before.
• Overall similarity to src-SH3
• differences
• - e.g. that RT loop does not pack onto to the
  rest of the protein (Fyn).
• conformational variability of ?-spectrin SH3
  (RMSD of C? 3.0 Å) smaller than of src (5.4 Å)
  and Fyn (6.0 Å)

two TSE structures energy maps of the native
state (above diagonal) and transition state
(below diagonal).
Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
46
Native topology in the transition state?

• Either direct examination of 3D structures,
• or interaction energy maps
• suggest that TSE is characterized by overall
  native-like topology.
• Quantify the topological similarity between TSE
  and native state
• Here use DALI server alignment of matrices of
  pairwise C? distances.
• to generate a representative set of structures of
  small proteins extract 311 domains of length
  40-70 residues from SCOP domain database.
• 179 can be meaningful aligned to src SH3.
• 11 domains have Z-score gt 9.0. All of them are
  SH3 domains.
• 168 have Z lt 4.3.

Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
47
Native topology in the transition state?
align 500 TSE structures to these 311
domains. In 479/500 cases, the best-matching
SCOP-domain is an SH3 domain! ? despite their
local variability, a large majority of the
calculated TSE structures have the fold
characteristic of an SH3 domain.
Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
48
DALI alignment of TSE structures against SCOP
domains
Z-score gt 5 indicates high structural
similarity. Therefore, the structural similarity
between the TSE and the best-matching SCOP is in
fact quite low.

• the large majority of TSE structures are located
  in the outer periphery of the region of
  conformational space that corresponds to the SH3
  fold.
• The rate-limiting step in folding seems the
  formation of a conformation with the global
  topology of the native state, see lecture 7.

Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
49
Solvent accessibility and secondary structure
Relative solvent accessible surface area in the
native state (black) and transition state (red)
of src SH3. Arrows, the five native
?-strands. Many portions of the protein are only
partially desolvated in the TSE!
Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
50
Solvent accessibility and secondary structure
Does secondary structure formation have a primary
role in protein folding? DSSPcont ? most highly
formed elements are strands ?3 and ?4 (formed in
gt 60 TSE structures of src and Fyn and in gt 45
for spectrin). Diverging turn preceding ?2 also
substantially populated. Experimentally, no
isolated hairpin has structure. Hairpin between
?3 and ?4 must be stabilized by tertiary
interactions.
However, peptide corresponding to diverging loop
adopts turn in solution.
Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
51
Network of interactions in native and transition
states
(a) Native state structure of src SH3. The
residues in the hydrophobic core are shown in
green and in ball-and-stick. (b,c) Graph
representation of the interactions in (b) the
native state and (c) the transition state. The
nodes on the graphs in b and c are colored using
the scheme shown in a. Only noncovalent
interactions between amino acids more than two
residues apart are considered. Network in TSE
is less condense, contains critical interactions
of hydrophobic core.
Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
52
Key network of interactions in the folding TS
Each point in the plot represents the result of a
TSE determination of src SH3 using one of 220
triplets of residues. The S-score measures the
topological similarity with the native state
high S -scores indicate high similarity. We
encircle triplets in the plot when these contain
residues at core position VII (Ala37, blue) and
VIII (Ile48, yellow). Highlighted in the protein
structure at the bottom left are six of the
hydrophobic core residues corresponding to core
positions IIIVI colored with core positions III
and IV green, V and VI red, VII blue and VIII
yellow. Bottom right, interaction network among
these six residues in the native and transition
states, colored according to the same code. Lines
are drawn when the average pairwise interaction
energy is lower than -0.5 kcal mol. Solid lines,
interactions present in both the native and
transition states dashed lines, interactions
present in the native state only.
Lindorff-Larsen, Vendrusculo, Paci, Dobson, Nat
Struct Biol 11, 443 (2004)
53
Trends

• Konzentration auf realistischere Modelle um
  wirkliche
• Proteine zu simulieren
• Einfluß äußerer Effekte (z.B. Kräfte oder
  Viskosität)
• Einfluß von Chaperonins
• Einfluß der Viskosität auf Faltungsdynamik.
• wurde seit langem vorhergesagt, z.B. durch
  Simulationen, und wurde vor kurzem zum ersten
  Mal exp. bestätigt.
• ? Diffusion wichtig für Proteinfaltung
• (z.B. Simulation durch Brownian Dynamics
  Simulationen)
• es sollte nicht die Transition-State-Theorie
  verwendet werden,
• sondern die Kramersche Theorie

54
Fazit
L. Serrano und Mitarbeiter, PNAS 99, 15846
(2002) Im Feld der Protein-Falter ist nun
anerkannt, dass die Kombination von Experiment
mit Theorie/Simulation die verbliebenen Rätsel
der Proteinfaltung lösen werden. Die Modelle
können wohl nur dann streng überprüft und
verbessert werden wenn das experimentelle
Know-how eine nächste Stufe erreicht. Ein
Schritt hier experimentelle Untersuchung von
Einzelmolekülen! Die Anstrengungen und
Erfahrungen im Blue-Gene-Projekt von IBM in einer
Vielzahl von Kollaborationen werden für die
theoretische Seite eine umfassende Evaluation der
bestehenden Methoden bedeuten. Neue Techniken
wie Replica-Exchange bewirken immer wieder
signifikante Verbesserungen.