Bestimmung

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Universität Szeged Medizinische Fakultät2009

• Bestimmung
• von HbA1c im Blut
• INSTAND e.V.
• Referenzlabor
• Dr. Patricia Kaiser

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HbA1c

• Bedeutender Parameter im
• eine glykierte Form des Hämoglobins
• spiegelt die mittlere Blutzuckerlage des letzten
  4-6 Wochen wider
• Therapieüberwachung
• Indikator für Therapieerfolg von Patient und
  Diabetesklinik

Qualitätsmanagement des Diabetes
Medizinische Analytik SS 2009
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Hämoglobin
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Medizinische Analytik SS 2009
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HbA0 Val His Leu Thr Pro
Glu Glu Lys
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Verfahren Prinzip erfasste Fraktionen Markenname
Säulenchromatographie Ionenaustausch- HbA1a,
HbA1b (Makrosäule) chromatographie HbA1c Mikrosä
ule Ionenaustausch- HbA1 chromatographie HPLC
Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b, Variant II,
Diamat chromatographie HbA1c HA8160,
L-9100 FPLC Ionenaustausch- HbA1a,
HbA1b, chromatographie HbA1c,
Aldimin-Form Affinitätschromatogrphie Phenylborat
säule Gesamt-Glyko GHb, IMx II hämoglobin Im
munologische z.B. Immun- HbA1c TinaQuant Verf
ahren turbidimetrie HA1c Dimension Referenzme
thode HPLC-ESI-MS HbA1c bzw. HPLC-CE
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HbA1c Routine-Methoden
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HbA1c Microsäulenmethode
In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut

• Testprinzip
• Herstellung eines Hämolysats aus der Blutprobe
• Auftragen des Hämolysats auf Ionenaustauschersäul
  e
• Elution der HbA1c-Fraktion
• Quantifizierung der HbA1c-Fraktion mittels
  Photometer bei 415 nm

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HbA1c Microsäulenmethode
In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
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HbA1c Microsäulenmethode
In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
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HbA1c Microsäulenmethode
In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
Diagnostische Bedeutung HbA1c spiegelt die
mittlere Blutzucker-Konzentration der letzten 6-8
Wochen wider und ist hiermit wertvoll für die
Verlaufskontrolle von Patienten mit Diabetes
Mellitus. Die HbA1c-Konzentration kann nach
folgender Formel in die mittlere Blutglucose
Konzentration (MBG) umgerechnet werden MBG
(mg/dL) 31,7 x HbA1c 66,1 MBG (mmol/L)
1,76 x HbA1c 3,67
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HbA1c Microsäulenmethode
In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
Referenzbereiche NGSP IFCC Microsäule
(Biocon) Stoffwechselgesunde 4.0 6.0 2.0
4.2 4.4 6.7 Diab. Zieleinstellung 6.0
6.5 4.2 4.8 6.7 7.3 Überwachungsbereich
6.5 8.0 4.8 6.4 7.3 9.1
Therapiebedarf gt 8 gt 6.4 gt 9.1 Für
diagnostische Zwecke sind die HbA1c-Ergebnisse
stets im Zusammenhang mit der Anamnese, der
klinischen Untersuchung und anderen
Untersuchungsergebnissen zu werten.
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• Einführung in die
• HPLC-MS Analytik

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HPLC-MS
Die HPLC-MS Technik ist ein Messverfahren, dass
in den letzten Jahren in der Medizinischen
Analytik zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. Im
Bereich der Laboratoriumsmedizin ermöglicht es
mit höchster Präzision und Richtigkeit die
Bestimmung von endogenen und exogenen Substanzen
z.B aus Blut oder Urin. Durch seine gute
Automatisierbarkeit wird es besonders bei hohem
Probenaufkommen ( high throughput) für die
Therapieüberwachung (therapeutic drug monitoring)
und z.B. für das Neugeborenen-Screening in
Routinelabors eingesetzt.

• HPLC High Pressure Liquid Chromatography
• chromatographisches Trennverfahren
• MS Mass Spectrometry
• analytisches Detektionsverfahren

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Chromatographie

• Farben schreiben oder zeichnen (griech.)
• auf Filterpapier Papierchromatographie
• auf Kieselgel- beschichteten Glas Dünnschichtchro
  matographie
• über mit Kieselgel-gefüllte Säulen Säulenchromato
  graphie

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Chromatographie
Ein einfacher Versuch zur Darstellung des
Prinzips der chromatographischen Säulen-Trennung
1. Grüne Blätter werden im Mörser zerrieben und
danach in Alkohol aufgelöst grüne Lösung
2. Grüne Lösung wird in eine Säule (gefüllt mit
feinem Seesand) oder auf ein rundes Kreidestück
gegeben
Blattfarbstoffe in Lösung
3. Einzelne Farbanteile verlassen wieder die
Säule getrennt gelbe, gelbgrüne, grüne,
blaugrüne
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Chromatographie

• Detektion
• z.B.UV-, Fluoreszenz-, ECD-, oder MS-
  Detektor

Signal Peak
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
HPLC High Pressure Liquid Chromatography
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Lösungsmittelflaschen
Entgaser
Pumpen
Probeninjektor
Detektor
Säule / Säulenofen
Abfall
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 1 Lösungsmittel wird von den Pumpen
angesaugt (blaue und orange Linien) und zum
Mischer gepumpt.
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 2 Gemisch wird zum Probengeber gepumpt
(Ventil)
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 3 Probenschleife wird mit
Lösungsmittelgemisch gefüllt
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 4 a Nach Probennahme aus dem Gläschen
wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch
injiziert (Ventil schaltet)
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 4b Nach Probennahme aus dem Gläschen
wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch
injiziert (Ventil schaltet)
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 5 Probe wird zur Säule transportiert
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 6 Probenbestandteile verlassen die Säule
nacheinander und werden im Detektor angezeigt
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu
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Massenspektrometrie
Mit Hilfe der Massenspektrometrie ist es
möglicht, Komponenten in komplexen Mischungen zu
identifizienen und quantifizieren. Zu diesem
Zweck werden die Analyte ionisiert in die
Gasphase überführt und nach ihrem
Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) sortiert
detektiert.
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Aufbau eines Massenspektrometers
Ionenquelle Massenanalysator GC/MS EI,
CI Quadrupole LC/MS ESI, APCI, APPI Ion
trap Biomolecules MALDI Time of Flight Triple
Quadrupole
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Triple Quadrupole System
Ion production
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Triple Quadrupole System
Schritt 1 Ionen-Erzeugung im ESI-Interface
Ion production
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Electrospray Ionization (ESI)
Verbindet HPLC mit MS Überführung des Analyten
flüssig ? gasförmig
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Triple Quadrupole System
Schritt 2 Ionen-Transport vom ESI-Interface ins
MS
Ion transport
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Triple Quadrupole System
Verschiedene Scan-Verfahren (Modi)
Selected Ion Monitoring (SIM)
Quadrupole full scan
Filter ions
Scan ions
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Triple Quadrupole System
Beispiel-Chromatogramme
Selected Ion Monitoring (SIM)
Quadrupole full scan
Quantifizierung einer bekannten Komponente über
das Molekül-Ion und Frakmentierung
Identifizierung von unbekannten
Komponenten (Information über Molekular-Gewicht)
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Triple Quadrupole System
Schritt 4 Frakmentierung des Analyten (precursor
ion) zu substanzspezifischen Bruchstücken
(product ions)
Fragmentation
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Triple Quadrupole System
Schritt 5 Ionen-Filter nach Frakmentierung
Ion filtering
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Triple Quadrupole System
Schritt 6 Detektion der heraus gefilterten Ionen
Ion detection
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Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied
Biosystems
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Qualitätsmanagement des Diabetes
DCCT-Studie
DCCT-Studie
Diabetes Control and Complication Trial
Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP -
Goldstein
Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP -
Goldstein
National Glycohemoglobin Standardization Program
Referenzmethode nach IFCC
Internationale Vergleichbarkeit auf höchster
Ebene der Richtigkeit
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NGSP Kalibration nach Goldstein et al.

• HPLC Methode mit
• Kationenaustauscher- Säule
• (BioRex 70)
• keine Trennung von HbA1c, HbF und
  carbamylierten Hämoglobinen
• Interferenz von HbA0 mit glykierten Hämoglobinen
• Interferenzen mit abnormen Hämoglobinen
• ? 2.1 Bias (abs.)

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DCCT-Studie
Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP -
Goldstein
Referenzmethode nach IFCC
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1. Hämolyse der Vollblut-Probe
1. Hämolyse der Vollblut-Probe
2. Proteolyse des Hämolysats
3. HPLC-ESI-MS-Analyse
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Glu Lys
Glu Lys
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1. Hämolyse der Vollblut-Probe
2. Proteolyse des Hämolysats
3. HPLC-ESI-MS-Analyse
3. HPLC-ESI-MS-Analyse
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HPLC-ESI-MS-Analyse
HPLC (Shimadzu) Pumpe A Pumpe B Mischkammer Aut
osampler Säulenoven Degasser Schaltventil Contro
ller
MS (Applied Biosystems) API 4000 Triplequadrupol
Massenspektrometer ESI-Quelle TurboVTM source
mit TurboIon SprayTM probe Software AnalystTM
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HPLC-ESI-MS-Analyse
HPLC-Bedingungen
Zorbax SB-CN, 5 µ 2.1 mm x 150 mm 50 C, 2
µl Eluent A 0.025 TFA in Wasser Eluent
B 0.023 TFA in Acetonitril Gradient 300
µl/min
Zeit min 0 3 9 13.5
13.6 17 17.1 23 B 0
0 5 5 100
100 0 stop
MS-Bedingungen
Scan type Q1 Multiple Ions Masse 348.3 amu
(nicht-glykiertes Hexapeptid) 429.3 amu
(glykiertes Hexapeptid) Dwell time 1
s Temperatur 500 C
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HPLC-ESI-MS-Analyse
LC-ESI-MS Chromatogramm einer Hämolysat-Probe
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Referenzmethoden

• Rückführbarkeit auf primären Standard
• - SI Einheiten
• - definierte Reinheit
• - definierte Messunsicherheit
• Vergleichbarkeit auf internationaler Ebene
• - Netzwerk (JCTLM, IFCC HbA1c)

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HPLC-ESI-MS-Analyse
HbA1c Kalibrationskurve nach IFCC
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Internationale Vergleichsmessung der IFCC
Working Group on HbA1c Standardisation
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Internationale Vergleichsmessung der IFCC
Working Group on HbA1c Standardisation
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Ringversuch 2005 HbA1c INSTAND e. V.
HbA1c
sample B
sample A
Referenzmethode
Routinemethoden
Probe Zielwert µg/L VK Bewertungs- grenzen µg/L Mittelwert µg/L VK Bestehensquote
A 5.52 2.07 4.41 - 6.63 5.59 8.2 97.2
B 10.5 2.19 8.39 -12.70 10.5 6.5 98.8
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HbA1c Messergebnisse nachIFCC Referenzmethode
und NGSP-Goldstein
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Darstellung von HbA1c - Werten
HbA1c Einheit NGSP abgeleitet IFCC
abgeleitet ab 2009 mmol/mol
bis 2008
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Master Equation
Umrechnung NGSP Werte in IFCC Werte
mmol/mol IFCC mmol/mol (NGSP -
2.15) / 0.0915
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Darstellung von HbA1c - Werten
HbA1c NGSP HbA1c IFCC mmol/mol new 4.0
20 5.0 31 6.0 42 7.0 53 8.0 64 9.0
75 10.0 86 Referenz-Bereich 4.0 6.0
20 42 mmol/mol
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
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ß-Kette von verschiedenen Hämoglobinen (N-Term.
AA 1-9)

• Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser HbA
• Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbS
• Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbC
• Gly-His-Phe-Thr-Glu-Glu-Asp-Lys-Ala HbF
• 1 3 6
  9 AA

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(No Transcript)
110
(No Transcript)