Title: M
1- MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS
21- INTRODUÇÃO
- POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS?
- QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS
DOS ENSAIOS QUE UTILIZAM ANTICORPOS?
31- INTRODUÇÃO
- 1.1- Principais características das Respostas
Imunes Adquiridas - Especificidade
- Diversidade
- Memória
- Especialização
- Autolimitação
- Não reatividade ao próprio
41- INTRODUÇÃO
- 1.1- Principais características das Respostas
Imunes Adquiridas - Especificidade conferida por duas moléculas
principais - - TCR presente na membrana de linfócitos
- - Anticorpos produzidos por linfócitos B,
presentes na membrana de linfócitos B e na forma
secretada, solubilizados em diversos fluidos
corporais.
51- INTRODUÇÃO
- 1.2- Principais isotipos de anticorpos
- IgM
- IgG
- IgA
- IgE
- IgD
61- INTRODUÇÃO
- 1.2- Principais isotipos de anticorpos
- IgM
- IgG encontrado em maior concentração no soro,
de obtenção mais fácil, sofre maturação de
afinidade - IgA
- IgE
- IgD
71- INTRODUÇÃO
- 1.3- Principais características dos Ensaios que
utilizam Anticorpos - -Especificidade Característica que indica que o
teste em questão identificará somente o antígeno
ou o anticorpo desejado. - Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência
de resultados falsos-positivos, MENOR a
ocorrência de reações cruzadas. - Dependente do tipo de anticorpo e antígeno
empregado no teste, e do sistema de detecção da
interação Ag-Ac.
81- INTRODUÇÃO
- 1.3- Principais características dos Ensaios que
utilizam Anticorpos - -Sensibilidade Característica inerente ao método
estreitamente relacionada com a quantidade mínima
de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada - Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e
detecção da interação Ag-Ac. - Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes,
quimioluminescentes.
91- INTRODUÇÃO
- 1.4- Fatores a serem analisados na escolha do
método - Sensibilidade
- Especificidade (confiabilidade de resultados)
- Custo
- Disponibilidade de material
- Segurança
- Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser
detectado e espécie animal a ser analisada - Tempo de realização do método.
101- INTRODUÇÃO
- 1.5 Aplicações dos métodos
- - Identificação e/ou quantificação de moléculas
específicas em fluidos biológicos - Purificação de proteínas
- Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e
hipersensibilidades - Identificação de genes e seus produtos
- Localização de moléculas específicas em células e
tecidos.
112- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- HISTÓRICO
- CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS QUE EMPREGAM ANTICORPOS - VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS
- de
122- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- 2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de
polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma
enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em
presença de substância cromógena, amplificará a
detecção da interação Ag/Ac através da formação
de cor - Variações da Técnica ELISA Quimioluminescente,
ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo
132- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
14ELISA INDIRETA
Anticorpo conjugado
IgM a ser detectada
Antígeno purificado
IgM inespecífica
TMB
152- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- 2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA
162- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- 2.5- ELISA
- Vantagens Método altamente sensível e
específico, com alto grau de confiabilidade como
ensaio quantitativo, custo baixo a médio. - Desvantagens Devido a alta sensibilidade,
pequenas variações de pipetagem e tempo de
incubação podem ocasionar resultados alterados
em extratos de antígenos, não se pode precisar a
qual antígeno houve a resposta ELISA de
competição muito susceptível a erros de
manipulação.
172- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica
Utilizados para detecção e localização de
antígenos em células e tecidos e para detecção de
anticorpos específicos em fluidos biológicos. - Métodos de alta especificidade e alta
especificidade - Utilização de anticorpos conjugados com
substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e
de anticorpos conjugados com enzimas
(Imunohistoquímica).
182- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica
192- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica
- Vantagens Alta especificidade e sensibilidade
possibilidade de detecção de proteínas
intracelulares e de sua localização, bem como do
tráfico intracelular. - - Desvantagens variação individual na leitura
de resultados de IFA alto custo de microscópio
de fluorescência técnicas especiais de fixação e
inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem
sempre disponíveis.
202- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- 2.7- Western-Blot Associação de técnica de
Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas
imunológicas - Permite a identificação do reconhecimento de
antígenos com peso molecular definido - Identificação de anticorpos que reconhecem
determinado antígeno em solução contendo diversos
antígenos - Permite a realização de cinética de expressão de
proteínas celulares.
212- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
222- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
232- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
- 2.7- Western-Blot
- Vantagens alta sensibilidade e especificidade
reconhecimento de antígenos individuais em um
extrato realização de perfil de reconhecimento
de antígenos e determinação de proteínas
imunodominantes - Desvantagens Custo médio a alto procedimento
longo e propenso a erros em diversos pontos
dependendo do sistema de revelação, pode-se ter
problemas de segurança.
243- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
- Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas
Andrew H. Lichtman. Quinta Edição, Elsevier
Editora - Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P.
Sittes Tristam. Décima Edição. Guanabara Koogan
Editora. - Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta
Edição. Roca Editora. - Imunologia. David Male, Ivan Roitt Jonathan
Brostoff. Sexta Edição. Manole Editora. - Imunobiologia O Sistema Imune na Saúde e na
Doença. Charles Janeway, Paul Travers Mark
Walport J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed
Editora. - Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray
Edwards. Oxford University Press. - Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow
David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press.