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m todos laboratoriais utilizando anticorpos – PowerPoint PPT presentation

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Title: M


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  • MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS

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1- INTRODUÇÃO
  • POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS?
  • QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS
    DOS ENSAIOS QUE UTILIZAM ANTICORPOS?

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1- INTRODUÇÃO
  • 1.1- Principais características das Respostas
    Imunes Adquiridas
  • Especificidade
  • Diversidade
  • Memória
  • Especialização
  • Autolimitação
  • Não reatividade ao próprio

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1- INTRODUÇÃO
  • 1.1- Principais características das Respostas
    Imunes Adquiridas
  • Especificidade conferida por duas moléculas
    principais
  • - TCR presente na membrana de linfócitos
  • - Anticorpos produzidos por linfócitos B,
    presentes na membrana de linfócitos B e na forma
    secretada, solubilizados em diversos fluidos
    corporais.

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1- INTRODUÇÃO
  • 1.2- Principais isotipos de anticorpos
  • IgM
  • IgG
  • IgA
  • IgE
  • IgD

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1- INTRODUÇÃO
  • 1.2- Principais isotipos de anticorpos
  • IgM
  • IgG encontrado em maior concentração no soro,
    de obtenção mais fácil, sofre maturação de
    afinidade
  • IgA
  • IgE
  • IgD

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1- INTRODUÇÃO
  • 1.3- Principais características dos Ensaios que
    utilizam Anticorpos
  • -Especificidade Característica que indica que o
    teste em questão identificará somente o antígeno
    ou o anticorpo desejado.
  • Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência
    de resultados falsos-positivos, MENOR a
    ocorrência de reações cruzadas.
  • Dependente do tipo de anticorpo e antígeno
    empregado no teste, e do sistema de detecção da
    interação Ag-Ac.

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1- INTRODUÇÃO
  • 1.3- Principais características dos Ensaios que
    utilizam Anticorpos
  • -Sensibilidade Característica inerente ao método
    estreitamente relacionada com a quantidade mínima
    de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada
  • Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e
    detecção da interação Ag-Ac.
  • Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes,
    quimioluminescentes.

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1- INTRODUÇÃO
  • 1.4- Fatores a serem analisados na escolha do
    método
  • Sensibilidade
  • Especificidade (confiabilidade de resultados)
  • Custo
  • Disponibilidade de material
  • Segurança
  • Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser
    detectado e espécie animal a ser analisada
  • Tempo de realização do método.

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1- INTRODUÇÃO
  • 1.5 Aplicações dos métodos
  • - Identificação e/ou quantificação de moléculas
    específicas em fluidos biológicos
  • Purificação de proteínas
  • Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e
    hipersensibilidades
  • Identificação de genes e seus produtos
  • Localização de moléculas específicas em células e
    tecidos.

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • HISTÓRICO
  • CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS
    LABORATORIAIS QUE EMPREGAM ANTICORPOS
  • VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS
  • de

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
    Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de
    polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma
    enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em
    presença de substância cromógena, amplificará a
    detecção da interação Ag/Ac através da formação
    de cor
  • Variações da Técnica ELISA Quimioluminescente,
    ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.5.1- ELISA Indireto

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ELISA INDIRETA
Anticorpo conjugado
IgM a ser detectada
Antígeno purificado
IgM inespecífica
TMB
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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.5- ELISA
  • Vantagens Método altamente sensível e
    específico, com alto grau de confiabilidade como
    ensaio quantitativo, custo baixo a médio.
  • Desvantagens Devido a alta sensibilidade,
    pequenas variações de pipetagem e tempo de
    incubação podem ocasionar resultados alterados
    em extratos de antígenos, não se pode precisar a
    qual antígeno houve a resposta ELISA de
    competição muito susceptível a erros de
    manipulação.

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica
    Utilizados para detecção e localização de
    antígenos em células e tecidos e para detecção de
    anticorpos específicos em fluidos biológicos.
  • Métodos de alta especificidade e alta
    especificidade
  • Utilização de anticorpos conjugados com
    substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e
    de anticorpos conjugados com enzimas
    (Imunohistoquímica).

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica
  • Vantagens Alta especificidade e sensibilidade
    possibilidade de detecção de proteínas
    intracelulares e de sua localização, bem como do
    tráfico intracelular.
  • - Desvantagens variação individual na leitura
    de resultados de IFA alto custo de microscópio
    de fluorescência técnicas especiais de fixação e
    inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem
    sempre disponíveis.

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.7- Western-Blot Associação de técnica de
    Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas
    imunológicas
  • Permite a identificação do reconhecimento de
    antígenos com peso molecular definido
  • Identificação de anticorpos que reconhecem
    determinado antígeno em solução contendo diversos
    antígenos
  • Permite a realização de cinética de expressão de
    proteínas celulares.

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.7- Western-Blot

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.7- Western-Blot

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2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  • 2.7- Western-Blot
  • Vantagens alta sensibilidade e especificidade
    reconhecimento de antígenos individuais em um
    extrato realização de perfil de reconhecimento
    de antígenos e determinação de proteínas
    imunodominantes
  • Desvantagens Custo médio a alto procedimento
    longo e propenso a erros em diversos pontos
    dependendo do sistema de revelação, pode-se ter
    problemas de segurança.

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3- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
  • Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas
    Andrew H. Lichtman. Quinta Edição, Elsevier
    Editora
  • Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P.
    Sittes Tristam. Décima Edição. Guanabara Koogan
    Editora.
  • Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta
    Edição. Roca Editora.
  • Imunologia. David Male, Ivan Roitt Jonathan
    Brostoff. Sexta Edição. Manole Editora.
  • Imunobiologia O Sistema Imune na Saúde e na
    Doença. Charles Janeway, Paul Travers Mark
    Walport J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed
    Editora.
  • Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray
    Edwards. Oxford University Press.
  • Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow
    David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
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