T

1
Técnicas de Imunologia

• Citometria de Fluxo
• Aplicações

2
Identificação Celular por Dispersão FS e SS
3
Imunofenotipagem
4
IOTest 3 Combinations List

• 24 Relevant Tubes
• 2 Controls
• One tube is for intra-cellular testing
• Kappa Lambda polyclonals from Dako
• FITC- and PE-conjugations performed at IOT

5
IOTest 3 Combinations List Target Diseases
6
IOTest 3 Combinations List Target Diseases
7
Quantificação antigénica
8
Quantificação de antigénios em Citometria de Fluxo
9
BioCytex MARQUIS TECHNIQUE

• Beads contain calibrated amounts of anti-mouse
  IgG molecules.
• Size mimics size of target molecule/receptor.
• Amount of molecules on beads reflects expression
  level of target molecule/receptor.

10
CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit

• -Flow Analysis Procedure
• Calibration Beads

11
CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit

• -Flow Analysis Procedure
• Negative Control

12
CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit

• -Flow Analysis Procedure
• CD38 Positive Sample

13
CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit

• -Data Analysis Procedure

14
Pesquisa de populações raras
15
Estudos Cinéticos
16
Análise de Ciclo Celular
17
Apoptose
18
Separação Celular
488 nm laser

• Formação de gotículas
• Tempo
• Coincidência - Pureza e Eficiência

19
QC Workflow
Patient Analysis
Basic Elements of Daily QC
Test Reimbursement
FAIL
PASS
20
AUTOMATIZAÇÃO
PrepPlus
21
TQ-Prep / ImmunoPrep Reagent

• Sistema automático de lisis de eritrocitos
• No requiere lavado
• Preserva la morfología
• Utiliza carruseles compatibles con XL-MCL, FC500,
  PrepPlus y CellPrep

22
PrepPlus TQ-Prep

• Sistema automático de carga de muestra y
  reactivos para citometría de flujo
• Utiliza tubos primarios de cualquier marca
• Rack de hasta 24 tubos primarios con agitación
  para homogeneizar la muestra
• Controlado por el TQ-Prep

23
PrepPlus TQ-Prep

• Posibilidad de carga desde tubo abierto
• 3 soportes diferentes para reactivos
• Puede cargar anticuepos monoclonales, FlowCount y
  reactivos de control de calidad

24
CellPrep

• Sistema de lavado celular por fibra hueca
• Sustituye a la centrifugación
• Mantiene la viabilidad celular
• Mantiene la morfología y preserva células lábiles
• No activa ni destruye plaquetas
• Utiliza sangre entera, sangre lisada y cualquier
  suspensión celular

25
CellPrep

• Fibras huecas con poros de 0.65 µm, que permiten
  la salida de moléculas y líquido de la suspensión
  original
• Permite la concentración final de la muestra
• Diferentes programas pregrabados, así como
  posibilidad de crear programas propios

26
Citometria de Imagem Uma nova Tecnologia no
apoio à Anatomia Patológica
27
Tipos de amostras possiveis de analisar por
Citometria de Imagem
28
Parâmetros possíveis de analisar por Citometria
de Imagem

• Total de partículas
• Forma
• Tamanho
• Área
• Diâmetro
• Perímetro
• Perfeição
• Irregularidade

29
Requisitos Básicos num Citómetro de Imagem
30
Captação dos Parâmetros de Análise
31
Citometria de Imagem
32
Protocolo para Citometria de Imagem

• Partindo de um fragmento de tecido sólido, fixado
  em formol, processado e incluído em parafina.
• Corte a 8?m, extensão em lâminas de gelatina
• Desparafinar
• Pós fixar com fixador de Bohm
• Hidratar
• Efectuar uma Hidrólise Ácida
• Marcar as células com reagente de Shiff
• Lavar com SO2
• Desidratar
• Montar
• Quantificar o conteúdo em ADN e o ciclo celular
  no Citómetro de Imagem

33
MetaCyte - concept

• microscope slide is scanned field by field at
  lowest possible magnification without gaps
• objects of interest are automatically identified
  gallery images, object features and positions are
  recorded

34
MetaCyte - concept

• on screen review of analyzed cells
• false positives can be rejected
• cells suitable for analysis are preselected with
  a mouse click
• preselected objects can be automatically
  relocated at100x to capture highresolution
  images for analysis

35
MetaCyte - concept

• histogram or scatter plot display of measured
  features
• gating for selection of subpopulations
• relocation of cells detected in a previous scan
  after re-staining

36
MetaCyte - concept
CCD Camera
Motorizedstage (x,y)
Motorized microscope (z)