Motilit

1
Motilità e Citoscheletro

• MOVIMENTI INTRACELLULARI E MOTILITA DELLE
  CELLULE STESSE
• Indispensabili per la sopravvivenza di molti
  organismi
• Spermatozoo, globuli bianchi, neuroni
• CITOSCHELETRO
• Impalcatura interna delle cellule
• Supporto alle proteine motrici
• Assemblaggio e disassemblaggio delle proteine del
  CS producono movimento

2
Adesione e Matrice Extracellulare

• MOLECOLE DI ADESIONE
• Cell-cell cell-strutture circostanti
• Integrità e comunicazione tissutale
• MATRICE
• Supporto, protezione, riserve energetiche,
  ancoraggio per cell e tessuti

3
CITOSCHELETRO Sistema di filamenti che svolge
funzioni sapaziali e meccaniche nella cellula

• organizzazione spaziale delle cellule
• forma e movimento
• riarrangiamento dei componenti interni durante
  la crescita e la divisione cellulare
• mitosi
• traffico intracellulare di organelli e molecole
• sostegno alla membrana plasmatica
• guida la crescita della parete cellulare
  vegetale

4
FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO

• Filamenti di actina (microfilamenti)
  determinano la forma della superficie cellulare e
  sono necessari per la locomozione dellintera
  cellula (lamellipodi, filipodi)
• Microtubuli determinano le posizioni degli
  organelli e dirigono il trasporto intracellulare
  (formazione del fuso mitotico, cilgia e flagelli)
• Filamenti intermedi forniscono forza meccanica e
  resistenza agli stress (involucro nucleare,
  assoni)
• Proteine accessorie sono essenziali per
  lassemblaggio controllato dei filamenti del
  citoscheletro, comprendono i motori proteici che
  muovono gli organelli o i filamenti stessi.

• Strutture dinamiche e adattabili
• Cambiano o persistono per archi di tempo
  variabili
• Composte da diverse subunità macromolecolari
• Le caratteristiche di tali componenti unitarie
  conferiscono le proprietà del filamento finale

5
Filamenti di Actina

• Polimeri elicoidali a 2 filamenti della proteina
  ACTINA
• Strutture flessibili
• 5-9nM
• Fasci lineari
• Reti bidimensionali
• Gel tridimensionaliconcentrati soprattutto nella
  corteccia

6
Microtubuli

• Cilindri cavi
• Unità tubulina (alfa e beta)
• 25nM
• Rigidi
• MTOC centrosoma

7
Filamenti Intermedi

• Unità famiglia eterogenea di proteine
• 10nM
• Lamina nucleare, assoni, tessuti epiteliali

8
PROTOFILAMENTI

• I polimeri del citoscheletro sono costituiti
  lunghe file di subunità unite per le estremità,
  che si associano fra loro lateralmente.
• Tenute insieme da interazioni idrofobiche e
  legami non covalenti deboli
• Le posizioni e i tipi di contatti sono diversi
  per i diversi filamenti.

9
NUCLEAZIONE
10
NUCLEAZIONE

• la polimerizzazione dipende dalla concentrazione
  di subunità non polimeriche
• Concentrazione critica quando il tasso di
  associazione e dissociazione si equivalgono
• Punto stazionario
• proteine speciali per catalizzare la nucleazione
  dei filamenti in siti specifici, determinando la
  posizione in cui si assemblano nuuovi filamenti
  del citoscheletro

11
POLARITA DEI FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO

• il terminale con il tasso di polimerizzazione
  maggiore è detto terminale () (plus end)
• il terminale con il tasso di polimerizzazione
  minore è detto terminale (- ) (minus end) MT
  subunità alfa Actina estremità ATP

12

• I filamenti del citoscheletro possono
  organizzarsi in strutture di ordine superiore
• I filamenti intermedi formano legami crociati e
  si associano in fasci molto forti associazione
  mediata anche da proteine come la filaggrina
  (forma fasci di filamenti di cheratina), la
  plectina (forma fasci di vimentina)
• i filamenti di actina possono organizzarsi con
  proteine che formano fasci (legami crociatitra
  filamenti di actina)e proteine che formano gel
  (tengono insieme due filamenti di actina angolati
  tra loro)

13
Regolazione della dinamicità del citoscheletro
(formazione di fasci, allungamento o
accorciamento)

• ATTIVAZIONE DELLE PIASTRINE
• Cellule anucleate
• Circolano nel sangue
• Formano coaguli nei siti di ferite
• Contatto con vaso danneggiato o segnale chimico
  esterno (ex, trombina) attivazione
• Cascata segnale
• Rapido influsso intracell di Ca2
• Attivazione delle proteine che regolano lactina
  (inattivazione delle prot che bloccanono
  lallungamento)
• Rapido allungamento dei filamenti di actina
• Formazione di fasci e reti di actina lamellipodi
  e filipodi (inserimento nel sito del coagulo)
• Cessazione del segnale di attivazione (- Ca2)
  stabilizzazione vs depolarizzazione e
  allungamento piastrina bloccata nella nuova
  forma appiattita
• Miosina II contrazione dei filamenti di actina
  avvicinamenti dei bordi della ferita cui la
  piastrina è adesa

14
Attivazione delle piastrine
15
CONTATTI FOCALI
Tipo altamente specializzato di attacchi tra i
filamenti di actina e matrice extracellulare che
permette alle cellule di esercitare una trazione
sul substrato a cui sono attaccate
FIBRE DA STRESS
A livello dei contatti focali, consistono di
fasci contrattili di filamenti di actina e di
miosinaII che terminano in corrispondenza della
membrana plasmaticadove si localizzano gruppi di
proteine di adesione transmembrana (integrine).
16
Organizzazione dellactina nella cellula
17
PROTEINE MOTRICI

• Motori molecolari
• Si associano alle fibre polarizzate del
  citoscheletro
• Usano lenergia derivata dallidrolisi dellATP
  per muoversi lungo di esse
• Si differenziano per il filamento a cui si
  attaccano, per la direzione in cui si muovono e
  per il cargo che portano
• Trasporto di componenti subcellulare (organelli,
  cromosomi)
• Conferiscono forza alla rete dei polimeri
  determinano la forma della cell
• dopo aver svolto lazione motoria possono
  staccarsi dal filamento.
• DUE REGIONI
• Testa dominio motore (idrolisi dellATP)
• Coda autoassemblaggio delle prot motrici
  associazione al cargo
• Dà specificità ai diversi tipi di motore
• Spostamento del motore sul filamento (quando il
  filamento è ancorato) o del filamento stesso per
  mezzo dei motori (quando i motori soni ancorati).

18
Tipi principali di proteine motrici

• Miosina
• Chinesina
• Dineina

19
Miosina (actina)

• Miosine uniche proteine motrici che si muovono
  su binari di actina
• Diversi tipi di miosina struttura e
  localizzazione
• Tutti i tipi di miosina si muovono verso
  lestremità di un filamento (differenti
  velocità)
• eccezione miosina VI
• Miosina II
• generazione della forza necessaria alla
  contrazione muscolare
• Prima proteina motrice identificata

20
Miosina II

• Proteina allungata formata da 2 catene pesanti
  (rosso) e 2 copie di 2 tipi di catene leggere
  (blu).
• Catena pesante dominio di testa globulare
  allN-terminale (motore) e una lunga sequenza
  amminoacidica che forma un coiled-coil -alfa
  eliche superavvolte- (media la dimerizzazione
  attrverso).
• Catene leggere si legano vicino alle teste
• Sempre associata ad attività contrattile sia in
  cellule muscolari che non
• Citochinesi
• Divisione cellulare
• Migrazione cellulare

21
Filamenti spessi

• Le code possono formare un fascio con altre
  molecole di miosina (interazioni coda-coda
  filamenti spessi bipolari)

22
Generazione della forza motrice Idrolisi ATP
cambio conformazionale

• Configurazione rigor
• No ATP
• La testa di Miosina lega saldamente il filamento
  di actina
• Durata breve (nel muscolo)
• Termina con lattacco di un nucleotide trifosfato
• Legame ATP
• Cambio conformazionale lievedei domini che
  compongono il sito di attacco con lactina
• Ridotta affinità actina-miosina
• Distacco il movimento è consentito

23
Generazione della forza motrice Idrolisi ATP
cambio conformazionale

• Idrolisicambio conformazionale notevole
• Spostamento della testa sul filamento di 5nM
• ATP e Pi legano sempre la miosina
• Nuovo legame actina- miosina
• Rilascio del Pi
• Colpo di potenza

24
Generazione della forza motrice Colpo di potenza

• La testa di miosina riguadagne la conformazione
  iniziale sul filamento di actina
• No nucleotide
• La miosina lega lactina in una nuova posizione
• Inizio di un nuovo ciclo

25
FIBRE MUSCOLARI

• cellule multinucleate
• Miofibrilla
• Sarcomero
• Filamenti sottili actina
• Estremità disco Z (estremità del sarcomero)
• Estremità - filamenti spessi
• Filamenti spessi miosina II
• Accorciamento del sarcomereo (contrazione)
  scivolamento delle fibre (non accorciamento delle
  stesse)
• Processo dipendente dalla Ca2

26
Disco Z allestremità del sarcomero, sito di
attacco per le estremità dei filamenti
sottili. Linea M è la posizione di proteine che
collegano filamenti adiacenti di miosina fra
loro. Banda chiara filamenti sottili
27
Chinesina (microtubuli)

• proteina motrice identificata nellassone gigante
  di seppia
• composta da 2 catene pesanti e 2 leggere (2
  domini motori globulari e un coiled-coil
  allungato responsabile della dimerizzazione)
• Motore N-terminale movimento in direzione
• KRP
• coinvolta nel trasporto anterogrado (trasporto
  assonale veloce) di molecole (RE), dal corpo
  cellulare, verso la terminazione dellassone

28
Ciclo della Chinesina

• Chinesina 50 lega 50 non lega il MT durante
  il ciclo di H-lisi dellATP
• Attacco dellATP alla testa della chinesina che
  lega il MT spinge in avanti la seconda testa
  (legata allADP)
• La seconda testa lega il MT
• LH-lisi dellATP su una testa e il distacco
  delADP sullaltra riporta alla conformazione
  iniziale ma con le teste invertite e con uno
  spostamento spaziale

29
Miosina vs chinesina

• Miosina
• passo singolo ma lungo
• Ciclo rapido
• Opera come un fascio
• Chinesina
• Passi multipli, ma brevi
• Ciclo più lento
• Opera come unità singola

30
Dineine (microtubuli)

• composte da 2 o 3 catene pesanti (comprendono il
  dominio motore) e un numero grande e variabile di
  catene leggere associate
• si muovono verso lestremità (-) dei microtubuli
• coinvolte nel trsaporto retrogrado di molecole
  (Golgi) o organelli racchiusi in vescicole dalla
  terminazione, verso il corpo cellulare del
  neurone
• DINEINE CITOPLASMATICHE omodimeri di catene
  pesanti con 2 grandi domini motori come teste
• DINEINE ASSONEMALI eterodimeri ed eterotrimeri
  con 2 o 3 domini di testa coinvolte nello
  spostamento veloce di microtubuli nelle ciglia

31
MODELLO PER LATTACCO DI DINEINA AD UN ORGANELLO
La dineina richiede lassociazione con dinactina
(complesso proteicoche comprende un filamento
simile allactina che interagisce con complessi
proteici presenti sulle membrane degli organelli)
per svolgere la sua funzione
REGOLAZIONE fosforilazione, cAMP.
32
CIGLIA E FLAGELLI

• Sono strutture mobili costituite da microtubuli
  e dineine
• strutture mobili altamente specializzate ed
  efficienti
• appendici cellulari con un fascio di microtubuli
  centrale

FLAGELLI

• Su spermatozoi e in molti protozoi
• movimento ondulatorio permette alle cellule di
  nuotare in mezzi liquidi

CIGLIA

• più corte dei flagelli ma organizzate in modo
  simile
• movimento a frusta
• cicli di ciglia adiacenti sono sincronizzati ma
  non esattamente (movimento ad onda)
• muovono singole cellule in un fluido o muovono
  un fluido sulla superficie di un gruppo di
  cellule in un tessuto (vd. Apparato respiratorio)

33
Movimento di ciglia e flagelli Forza
perpendicolare allasse dellassonema
Disposizione dei MT a 92 nellassonema di
ciglia e flagelli
34
(No Transcript)
35
CORPI BASALI strutture che radicano ciglia e
flagelli alla Superficie cellulare. Composti da 9
gruppi di triplette di Microtubuli fusi

• FLAGELLI BATTERICI
• Flagellina
• Rotazione ad elica

36
MOVIMENTO CELLULARE
POLARIZZAZIONE DI CELLULE DI LIEVITO coinvolge
lACTINA durante la gemmazione e i MICROTUBULI
nella polarizzazione morfologica (risposta a
fattori di accoppiamento)
37
CELLULE CHE STRISCIANO SU UN SUBSTRATO SOLIDO
processo integrato e complesso che dipende dalla
corteccia cellulare ricca di actina coinvolte 3
attività.
PROTRUSIONE Filipodi 1D Lemellipodi
2D Pseudopodi 3D
ATTACCO
TRAZIONE

• Sviluppo, embriogenesi, neuroni
• Animale adulto, risp immunitaria, osteoblasti,
  fibroblast (connettivo)
• Patologie, tumori

38
Lamellipodi e increspature
Fibroblasti in coltura su un foglio di gomma al
silicone
39
Organizzazione dei microtubuli in fibroblasti e
neuroni
40
Cono di crescita dei neuroni
41
MATRICE EXTRACELLULARE

• insieme di proteine e polisaccaridi, secrete da
  diversi tipi di cellule, che costituiscono
  strutture extracellulari in grado di svolgere
  diverse funzioni
• diversa concentrazione delle diverse componenti
  della matrice dà origine a strutture molto
  diverse tra loro (es, tendini, cartilagini
  dellosso)
• funzione principale di sostegno
• altre funzioni di regolazione della divisione
  cellulare, adesione, motilità e migrazione
  cellulare (distruzione controllata della matrice
  ad opera di proteasi), differenziamento durante
  lembriogenesi
• le funzioni diverse dipendono dalle sostanze che
  la compongono e dalla loro particolare
  disposizione

42
Le cellule che producono le molecole della
matrice sono essenzialmente fibroblasti In
certi tipi specializzati di tessuti connettivi
(cartilagine e osso) tali molecole sono secrete
da cellule della famiglia dei fibroblasti più
specializzate (es, condroblasti e osteoblasti)
43
Due classi principali di macromolecole
extracellulari compongono la matrice
extracellulare - catene polisaccaridiche della
classe chiamata glicosamminoglicani (GAG), che si
trovano di solito uniti covalentemente a proteine
sotto forma di proteoglicani -
proteine fibrose, fra cui collagene, elastina,
fibronectina e laminina che hanno funzioni sia
strutturali che adesive.
Le molecole di proteoglicano nel tessuto
connettivo formano una sostanza basale simile a
gel altamente idratata in cui le proteine fibrose
sono immerse. Le fibre di collagene rafforzano e
aiutano ad organizzare la matrice e fibre di
elastina simili a gomma le danno elasticità.
44
GLICOSAMMINOGLICANI
Sono catene polisaccaridiche non ramificate
composte da unità ripetute di disaccaridi. Uno
degli zuccheri è sempre uno zucchero amminico
(nella maggior parte dei casi è solfato). Il
secondo zucchero è di solito un acido uronico
(glucuronico o iduronico)
45
PROTEOGLICANI
Sono prodotti dalla maggior parte delle cellule
animali. La catena polipeptidica, o nucleo
proteico, è prodotta dai ribosomi del RER e
introdotta nel lume. Le catene polisaccaridiche
sono assemblate su questo nucleo principalmente
nellapparato del Golgi. Qui vengono anche
aggiunti gli zuccheri.
46
COLLAGENI
Famiglia di proteine fibrose secrete da cellule
del tessuto connettivo e da una varietà di altri
tipi cellulari. Sono le proteine più abbondanti
nei mammiferi (costituiscono pelle ed osso).
Danno origine a fibre semicristalline che tengono
in posizione le cellule, conferiscono resistenza
alla tensione ed elasticità alla matrice
svolgono funzioni importanti nellambito della
mobilità e dello sviluppo delle cellule.
Glicoproteine per lo più insolubili,
caratterizzate da un contenuto elevato di Gly e
di 2 aa modificati idrossi-Lys e idrossi-Pro.
47
Singole molecole di collagene sono strutture
lineari costituite da 3 catene polipeptidiche. Le
singole catene, dette catene a, si avvolgono a
formare unelica sinistrorsa a passo lungo. I
residui di Pro, a spaziatura regolare, sono
importanti per la stabilizzazione di questa
struttura elicoidale.
3 catene a si associano tra loro a formare una
tripla elica destrorsa, relativamente rigida
tale struttura è possibile grazie all spaziatura
regolare dei residui di Gly (stanno nellasse
centrale). La tripla elica è responsabile della
natura fibrosa . A seconda del tipo di collagene,
la tripla elica può essere continua, o può
contenere regioni che danno origine a strutture a
conformazione meno ordinata. Questi elementi
fungono da regioni cardine e danno maggiore
flessibilità.
48
FIBRE ELASTICHE
Rete nella matrice, possono tenere insieme fibre
di collagene. Componente principale è lELASTINA
(proteina altamente idrofobica, ricca di Pro e
Gly, non glicosilata). Lelastina è prodotta a
partire da un precursore (TROPOELASTINA) solubile
secreto nello spazio extracellulare ed è
assemblata in fibre vicino alla membrana
plasmatica. Segue la formazione di legami
crociati che permette la formazione di una rete.
49
FIBRONETTINA
Grossa glicoproteina, dimero composto da 2
subunità molto grandi unite da legami disolfuro
ad una estremità. Ciascuna subunità è ripiegata
in una serie di domini funzionali distinti
separati da regioni di catena polipeptidica
flessibile. Può dare fibrille.
50
LAMINE BASALI
Sottili tappeti flessibili di matrice
specializzata, sottostanti ai fogli e tubi di
cellule epiteliali. Funzione di separazione e
filtro (glomerulo) determinano la polarità
cellulare , influenzano il metabolismo.
Sintetizzata in gran parte dalle cellule che si
trovano su di essa fibrille di ancoraggio
composte soprattutto da collagene di tipo IV.
Ruolo ISTRUTTIVO nella rigenerazione (giunzione
neuromuscolare).
51
(No Transcript)
52
GIUNZIONI CELLULARI
TESSUTO CONNETTIVO
Matrice extracellulare abbondante e cellule
distribuite in modo sparso al suo interno è la
matrice che sopporta lo stress meccanico. Gli
attacchi diretti tra una cellula e laltra sono
rari.
TESSUTO EPITELIALE
Cellule unite strettamente in foglietti chiamati
epiteli matrice extracellulare scarsa, consiste
di un tappeto sottile (lamina basale) che sta
sotto lepitelio. Ladesione cellula-cellula
sopporta la maggior parte degli stress meccanici.
(IMP contatto tra citoscheletro di cellule
adiacenti)
53
GIUNZIONI CELLULARI
Giunzioni specializzate, si trovano nei punti di
contatto cellula-cellula e cellula-matrice.
Classificate in 3 gruppi funzionali
classificazione funzionale delle giunzioni classificazione funzionale delle giunzioni
g. occludenti g. strette g. Settate (invertebrati)
g. di ancoraggio g. cellula-cellula g. cellula-matrice
g. comunicanti g. gap sinapsi chimiche plasmodesmosomi
54
g. occludenti
g. strette

• Permettono agli epiteli di servire da superficie
  di separazione, non permettono il passaggio di
  molecole.
• rete ramificata di filamenti sigillanti che
  contornano lestremità apicale di ciascuna
  cellula del foglietto epiteliale
• ciascun filamento è composto da una lunga fila
  di proteine di adesione transmembrana immerse in
  entrambe le membrane i domini extracellulari si
  uniscono tra loro per occludere

55
(No Transcript)
56
Proteine principali CLAUDINE (di diverso tipo,
presenti diversamente nelle giunzioni strette) e
OCCLUDINE (funzione incerta, si associano con
proteine periferiche intracellulari di membrana
chiamate PROTEINE ZO -zona occludens- che
ancorano i filamenti al citoscheletro di actina)
57
g. di ancoraggio
Forte struttura che attraversa la membrana ed è
attaccata al citoscheletro. Composte da 2 classi
principali di proteine

• proteinedi ancoraggio intracellulare (formano
  una placca sulla superficie citoplasmatica della
  membrana e connettono il complesso giunzionale o
  ai filamenti di actina o a filamenti intermedi)
• proteine di adesione transmembrana (coda
  citoplasmatica che si attacca a una o proteine
  di ancoraggio intracellulari e a un dominio
  extracellulare che interagisce con domini
  extracellulari di proteine di adesione
  transmembrana specifiche su unaltra cellula).

Molte giunzioni contengono proteine di
segnalazione intracellulare che rendono le
giunzioni capaci di segnalare allinterno della
cellula.
58
Le giunzioni aderenti esistono in 2 forme
funzionalmente diverse
g. aderenti caderine catenine

• Esistono in varie forme e sono presenti in molti
  tessuti non epiteliali
• punti di attacco tondeggianti o a striscia che
  connettono ndirettamente i filamenti di actina
  corticali di 2 cellule interagenti
• formano una cintura di adesione sotto le
  giunzioni strette
• morfogenesi
• un fascio contrattile di filamenti di actina si
  trova adiacente alla cintura orientato in senso
  parallelo alla membrana (legame actina-membrana
  tramite proteine come CATENINE, VINCULINA,
  a-ACTININA)

59
desmosomi

• punti di contatto intracellulare a forma di
  bottone che ancorano le cellule le une alle
  altre.
• Siti di ancoraggio per filamenti intermedi che
  formano una impalcatura strutturale resistente
  alla tensione
• Placca citoplasmatica composta da PLAKOGLOBINA e
  DESMOPLAKINA, DESMOGLEINA e DESMOCOLLINA.

60
Adesioni focali

• giunzioni cellula-matrice basate su INTEGRINE.
• rendono le cellule in grado di fare presa sulla
  matrice (integrine si legano allinterno della
  cellula a filamenti di actina)

61
emidesmosomi

• si connettono a filamenti intermedi
• connettono la cellula a una lamina basale
  (LAMININA)
• domini extracellulari legano la lamina basale,
  quelli intracellulari legano i filamenti di
  cheratina tramite la PLECTINA.

62
g. comunicanti

• costituite da proteine che formano canali
  (CONNESSINE) i canali formati (CONNESSONI)
  permettono il passaggio di ioni inorganici e
  altre piccole molecole solubili in acqua di
  passare da una cellula allaltra.
• Le giunzioni gap di tessuti diversi possono aver
  diverse proprietà (esistono connessine diverse).
• Sincronizzazione segnali elettrici (contrazione
  muscolare)
• Liberazione glucosio (segnale da epatociti
  innervati a epatociti non innervati)
• Possono essere regolate (pH, Ca2)
• protezione del passaggio di segnali nocivi da una
  cellula a quelle adiacenti
• Ex danno alla membrana, passaggio di ioni
  allinterno, gli ioni non devono diffondere alle
  cell vicine, chiusura delle giunzioni gap

g. gap
63
(No Transcript)
64
ADESIONI CELLULA-CELLULA
La motilità cellulare e ladesione si combinano
per far avvenire diversi processi morfogenetici
questi processi possono richiedere un meccanismo
che diriga le cellule alla loro destinazione
finale (CHEMOTASSI, CHEMOREPULSIONE, o GUIDA
DELLA VIA). Una volta che la cellula migrante ha
raggiunto la sua destinazione, deve riconoscere
altre cellule del tipo appropriato e unirsi a
loro per assemblarsi in un tessuto. Le cellule
aderiscono tra loro e alla matrice extracellulare
tramite proteine di superficie cellulare chiamate
MOLECOLE DI ADESIONE CELLULARE (CAM), che possono
o meno essere dipendenti dal calcio.
65
caderine

• CAM principale, calcio dipendente.
• superfamiglia di proteine che comprende caderine
  classiche e non
• la maggior parte sono proteine transmembrana a
  singolo passaggio, possono formare dimeri e
  oligomeri, a livello extracellulare 5 o 6
  ripiegamenti Ig simili

66

• mediano legame OMOFILICO
• sono unite al citoscheletro di actina da
  CATENINE (proteine di ancoraggio intracellulari)

• Fondamentali nel direzionare la morfogenesi,
  comparsa e scomparsa di alcuni tipi mediano lo
  sviluppo dellembrione

67
selettine

• proteine di superficie che legano carboidrati
  (LETTINE) che mediano una varietà di interazioni
  transitorie di adesione nel torrente
  circolatorio, che dipendono dal calcio
• 3 tipi L-, P-, E-selettina (linfociti,
  piastrine, endotelio)
• proteine transmembrana con dominio di lettina
  altamente conservato
• ruolo importante nellattaccodei globuli bianchi
  alle cellule endoteliali che rivestono i vasi
  sanguigni
• mediano unadesone debole (rotolamento)
• Espressione richiamo vs zone di infiammazione

68

• Super famiglia delle Immunoglobuline
• Adesione Ca2 indipendente
• N-CAM
• Derivano da splicing alternativo di un singolo
  gene
• Segnali intracell (vd. Src e fosforilazione)
• Legano lunghe catene di acido sialico
• Forte carica
• Adesione debole
• Ruolo nella segregazione cellulare

69
integrine Ca2/Mg2 dip

• recettori transmembrana principali sulle cellule
  animali per il legame con la maggior parte delle
  proteine della matrice extracellulare
• eterodimeri transmembrana (a e b)
• fanno da collegamento tra matrice e
  citoscheletro
• connesse a fasci di filamenti di actina tramite
  subunità b e reclutamento di TALINA, a-ACTININA,
  FILAMINA
• attività può essere modulata e può attivare vie
  del segnale

70
(No Transcript)
71
TECNICHE PER LO STUDIO DI ADESIONE E MIGRAZIONE
Test di aggregazione
Cellule in aggregato in coltura cellule libere
si valuta laggregazione (cellule di retina VS
cellule di fegato)
CAMPENOT CHAMBER
Test per valutare ladesione e il
differenziamento cellulare.

• Una petri viene coattata con collagene
• si scavano dei solchi con un pin-rake
• si posiziona una goccia di medium sui solchi
• si silicona la campenot e la si fa aderire sulla
  pertri (con le fessure perpendicolari ai solchi)
• si mette un po di medium nelle fessure laterali
  della campenot e si lascia in incubatore per 1
  ora
• si piastrano le cellule e si mettono a contatto
  con i fattori stimolanti.

PROTOCOLLO
72
MATRIGEL MATRIX
Il matrigel è una membrana basale solubile
derivante da estratti di sarcoma, indotto in topi
EHS,tumore che produce tipicamente molte proteine
della matrice extracellulare. Contiene
principalmente LAMININA, COLLAGENE IV,
PROTEOGLICANI SOLFORATI, FATTORI DI CRESCITA.
PROTOCOLLO

• preperazione di aggregati cellulari
• utilizzando una pipetta prerafreddata si
  posizionano gocce di matrigel su una piastra e si
  incubano a 37gradi (il matrigel gelifica)
• si seminano sul matrigel gelificato gli
  aggregati cellulari che vengono coperti con
  unaltra goccia di matrigel (incubazione a
  37gradi)
• aggiunta di medium con diversi trattamenti e
  fattori chemiotattici.

73
Analogamente si procede in test di aggregazione
su collagene
74
SOFT AGAR ASSAY
Base Agar collagene 1. Melt 1 Agar in microwave.
Warm 2X DMEM/F12 additives. 2. Mix equal
volumes of the two solutions. 3. Add 1.5ml/ Petri
dish, allow to set.   Top Agar 1.  Melt 0.7 Agar
in microwave. Also warm 2X DMEM/F12 additives
to the same temperature. 2. Trypsinize cells and
count. 3.  Add 0.1ml of cell suspension to 10ml
centrifuge tubes. 5. Label 35mm Petri dishes with
base agar appropriately 6. For plating add 3ml 2X
DMEM/F12 Additives and 3ml 0.7 Agar to a tube,
mix gently and add 1.5ml to each replicate plate
  7. Incubate assay at 37C in humidified
incubator for 10 - 14 days. 8. Stain plates with
0.5ml of 0.005 Crystal Violet for gt1 hour, count
colonies using a dissecting microscope.
75
camera di migrazione di BOYDEN
76
tests di microchemiotassi e camera di migrazione
di BOYDEN
colture cellulari
dispersione
sospensione unicellulare
semina
membrana
pozzetti contenenti il fattore
chemiotattico