Lip

1
Lipáz enzimaktivtás mérése
2
Lipidek

• Vegyületek heterogén csoportja
• Vízoldhatatlan
• Organizmusokban általában fehérjékkel
  (lipoproteinek), szénhidrátokkal (liposzaharidok)
  képzett vegyületei fordulnak elo
• A lipidek nagy része triglicerid formájában kerül
  a talajba
• A lebontás elso lépését a lipáz
  (triglicerid-acilhidroláz) enzim végzi
• A reakció során zsírsavak és glicerin szabadul fel

3
Zsírsavak

• Hosszú szénláncú karbonsavak
• Lehetnek telített-, telítetlen-, keto-, hidroxi-,
  epoxi-, elágazó szénláncú, vagy gyurus, savak.
• A leggyakoribbak a telítetlen zsírsavak cisz
  izomerjei

4
Zsírsavak bontása

• Aerob környezetben
• ß-oxidáció 2 szénatomos darabok lehasadásával
  bomlanak, melynek végterméke CO2 és víz
• Ritkább esetben a-, vagy s-oxidáció megy végbe.
  Ez esetben az oxidáció nem teljes
• Anaerob környezetben a zsírsavak feldúsulnak a
  környezetben

5
Az enzimaktivitás mérésének kivitelezése
6
Az eljárás alapelve

• A talajt 4-metil-umbelliferon-heptanoáttal (4-
  MUH) inkubáljuk 10 percen át 30C-on.
• A talaj lipáz aktivitására a felszabaduló,
  fluoreszcens 4-metil-umbelliferon (4-MU)
  mennyiségébol következtethetünk.
• Szükséges anyagok és felszerelések
• Fluoriméter
• Rázó vízfürdo
• Centrifuga, centrifuga csövek (10 ml)
• Erlenmeyer lombikok (25 ml)

7
Szükséges vegyületek, oldatok

• Etilén-glikol-monometil-éter
• 4-MUH (10mM)
• Oldjunk fel 58 mg 4-MUH-t 10 ml
  etilén-glikol-monometil-éterben, majd töltsük fel
  ugyanezzel az oldószerrel 20 ml-re (tárolás
  -20C-on). Az oldatot naponta készítsük el!
• TRIS (2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol)
  puffer (0,1 M, pH 7,5)
• 12,11 g TRIS-t oldjunk fel 700 ml desztillált
  vízben, 0,1M sósavval állítsuk a pH-t 7,5-re,
  majd töltsük fel 1000 ml-ig desztillált vízzel
• 4-MU standard oldat
• 176 mg MU-t feloldunk 70 ml etilén-glikol-monometi
  l-éterben, , majd feltöltjük ugyanezzel az
  oldószerrel 100 ml-re. Az oldat 4 C-on több
  napig eláll.

8
Az eljárás

• Helyezzünk 0,1 g nedves talajmintát 25 ml-es
  Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 4,5 ml TRIS
  puffert, zárjuk le és inkubáljuk 30C-on rázó
  vízfürdoben 10 percig
• Adjunk hozzá 0,5 ml 4-MUH szubsztrátot, rázzuk
  jól össze, zárjuk le és ismét inkubáljuk 30C-on
  rázó vízfürdoben 10 percig
• Ezután jeges vízbe helyezve a lombikot, hutsük le
  a mintákat
• Kontroll minta készítéséhez adjuk a szubsztrát
  odatot a talaj szuszpenzióhoz amint a lombikot
  huteni kezdjük
• Ezután 2C-on 4000 g-n centrifugáljuk a mintákat
• Spektrofluorimetriával vizsgáljuk a felülúszóban
  a felszabadult 4-MU mennyiségét (gerjesztési
  hullámhossz 340 nm, emissziós hullámhossz 450
  nm)

9
Kalibrációs görbe

• Hígítsuk a desztillált vízzel a 4-MU standard
  oldatot (1100)
• Helyezzünk 0,1 g talajmintát Erlenmeyer lombikba
  és adjunk hozzá 4,5 ml TRIS puffert, illetve 0
  0,1 0,2 0,3 0,4 és 0,5 ml 4-MU standard
  oldatot
• Adjunk 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 és 0 ml
  desztillált vizet az oldatokhoz, hogy
  kiegészítsük 5 ml-re
• Folytassuk Az eljárás dián leírtak szerint
• A standardek koncenjtrációja 0, 10, 20, 30, 40,
  50 nM
• A kalibrációs görbét minden talajmintához külön
  kell elkészíteni

10
Számítás

• Korrigáljuk az eredményeket a kontroll minta
  alapján
• Számítsuk az enzimiaktivtást a a következo képlet
  alapjánAhol U az enzimaktivitás
  (nMg-1dwt-110 min-1), MU a mért 4-MU
  koncentráció nmol/l-ben, dwt a 1 g talajminta
  száraz tömege, 0,1 a felhasznált talajminta
  száraz tömege.

11
Forrás

• Alef, K. Nanniperi, P. Methods in Applied Soli
  Microbiology and Biochemistry, 1995