PCR

1
PCRREAL TIME PCR

• Aras.Gör.Ayhan ÜNLÜ

2
DNA nin kimyasal yapisi
1953
1866
.Bitkilerde kalitimin esaslari
1957
1963
Sanger sekans prosüdürü.
Kornberg test tüpünde DNA.
1972
Bergilk recombinat DNA molekülü.
1966
Genetik kod
ilk konvansiyonel DNA bazli deneyler
1980s
PCR
1990s
2000
Ilk gen tedavileri
insan genomunun sekanslanmasi
Genetik gida mühendisligi
Dolly
3

• Ilk kez 1985'de bilim dünyasina sunuldugundan
  itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) hem
  arastirmada hem de klinik laboratuarlarda tanida
  yeni bir çigir açmistir. ABD'de Cetus sirketin'de
  çalisan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall
  K. Saiki tarafindan gelistirilmistir. Metod
  basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun kosullarda
  çogaltilmasidir. (Science,1985230,1350).
• Bu bulusundan dolayi K.Mullis, 1993 yili Nobel
  Kimya Ödülüne hak kazanmistir.

4
PCR Reaksiyonu?

• PCR reaksiyonunda üç temel basamak vardir ve
  çogaltilmis ürün miktari, bu üç adimin tekrarina
  baglidir.
• Denatürasyon (90-95 C)
• Primer baglanmasi (50-70 C)
• DNA sentezi (70-75 C)
• Bu üç adim bir PCR siklüsünü olusturur
• (Genetik Kavramlar S-515)

5

• Ilk adimda, çogaltilacak DNA denatüre edilerek
  tek zincirli hale getirilir. Bu DNA temiz olmak
  zorunda degildir ve genomik DNA, kurumus kan gibi
  adli tip örnekleri, uzun süre saklanmis tibbi
  örnekler,, tek bir saç teli, mumya kalintilari,
  fosil gibi degisik kaynaklardan elde edilebilir

(Genetik Kavramlar S-515)
http//www2.mtroyal.ab.ca/tnickle/3311/supplement
/PCR.jpg
Çift zincirli DNA isitilarak tek zincirli hale
getirilir.
6

• Sicaklik 50 ile 70 C arasinda bir degere
  düsürülür ve primerlerin tek zincirli hale
  getirilmis DNAya baglanmasi saglanir. Bu
  primerler yapay oliganükleotidlerdir (15-30
  nükleotid uzunlugunda) ve çogaltilacak DNA
  kisminin uçlarindaki tamamlayici dizilere özgül
  olarak baglanir.

(Genetik Kavramlar S-515)
http//www2.mtroyal.ab.ca/tnickle/3311/supplement
/PCR.jpg
Bu primerler, kalip DNA nin sentezi için
baslangiç görevi yapar.
7

• DNA polimerazin isiya dayanikli bir sekli
  reaksiyon karisimina ilave edilir ve DNA sentezi
  70 ile 75 C arasindaki sicaklikta gerçeklesir.

(Genetik Kavramlar S-515)
http//www2.mtroyal.ab.ca/tnickle/3311/supplement
/PCR.jpg
Bu primerler, kalip DNA nin sentezi için
baslangiç görevi yapar.
8
(No Transcript)
9
(No Transcript)
10
(No Transcript)
11

• PCR da kullanilan malzemeler
• Kalip DNA
• Reaction buffer (x 2,5 µl)
• forward primer (x 0,5 µl)
• reverse primer (x 0,5 µl)
• dNTP (x 4 µl)
• MgCl2 (x 2,5 µl)
• Taq Polimraz (x 0,25 µl)

12
PCRin Sinirlari

• Kisa ürünlerin elde edilmesi
• Kontaminasyona açik olma
• Taq DNA polymerase giderek inaktive olur. Taq DNA
  Polimerazin, yari ömrü 92.5'de 130 dk 95C'de
  40 dk'dir. Bu nedenledir ki PCR'in sonlarina
  dogru olan sikluslarda aktivitesi
  sinirlanmaktadir.
• Ortamda Fenol kalintilarinin bulunmasi PCR i
  inhibe eder.

13
Real Time PCR

• Son yilllarda PCR reaksiyonlarinda sicaklik
  döngüleri saglamak için kullanilan cihazlarin
  (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle
  birlestirilmesi, real-time PCR olarak
  adlandirilan yeni bir yöntemin gelismesine neden
  olmustur. Real-time PCRda ürünlerin analizi
  reaksiyon sirasinda yapilmaktadir. Bu nedenle,
  agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarinin mor
  ötesi isik altinda görüntülenmesi gibi islemlerin
  uygulanmasina gerek kalmamaktadir. Real-time PCR
  ürünlerinin kalitatif ve kantitatif
  analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan
  boyalardan ya da diziye özgün problardan
  yararlanilmaktadir.

14
Real-Time PCR Real-time PCR monitors the
fluorescence emitted during the reaction as an
indicator of amplicon production at each PCR
cycle (in real time) as opposed to the endpoint
detection
Real-Time PCR Real-time PCR Reaksiyon esnasinda
her bir PCR siklüsünde yeterli miktarda ürünün
verdigi floresans isiga göre çalisip reaksiyonu
asama asama sonuna kadar olusan ürünü kontrol
eden bir sistemdir.
15
Gerçek Zamanli PCR( Real Time PCR )

• Isima özelligine sahip moleküller
  kullanarak PCRi olusurken izleme ve miktar
  belirleme yöntemidir.

16
Gerçek zamanli PCR
Sinyal üretimi Amplikon miktarini PCRin
linear fazinda izlemek Primer/prob/amplikonla
rin florojenik moleküllerle
Isaretlenmesi Cihaz Sinyali saptamak ve
degerlendirmek Thermal cycler Eksitasyon-Emisyon
sistemleriBilgisayar
17
Gerçek Zamanli PCR
DNAya baglanan Fluoroforlar
Isaretli Oligoproblar
5 - eksonükleaz problar
Ardisik oligoproblar
Molecular beacon lar
Isaretli primerler
18
GERÇEK ZAMANLI PCR
Kantitasyon
Erime egrisi (Tm) analizi
Multipleks uygulamasi
19
(No Transcript)
20

• KLASIK PCR
• PCR sonundaki ürünler (amplikonlar) saptanir
  analiz edilir.
• REAL TIME PCR
• (GERÇEK ZAMANLI PCR)
• ? PCR devam ederken ortaya çikan ürünler
  saptanmaya basladigi anda degerlendirmeye alinir.

21

• Real-time PCRin Prensipleri
• Bir flöresan röporterin kantitasyonu
• ve tanisi üzerine kurulu
• PCR ürünlerinin miktarindaki ilk önemli artis
  (CT - threshold cycle) hedef templatein
  baslangiç miktari ile orantilidr

22
Klasik PCRda Problemler

• Primer seçimi ve dizayni
• Termalcycler programlari
• Reaksiyon sartlari
• Zaman alan analiz islemleri
• Bir testin optimizasyonu
• Agaroz jel elektroforezi, Blotlama
• Kontaminasyon riski

23
Real-time PCRin avantajlari

• Spesifik olmayan amplifikasyonlardan
  etkilenmiyor
• Reaksiyon boyunca veri toplanarak ayni anda
  analiz imkani
• PCR sonrasi ürünlerin ikincil bir islemi
  gerekmiyor
• (yüksek verimlilik,düsük kontaminasyon
  riski)
• ultra-rapid siklus (30 dak. to 2 saat)
• 10¹º kati bulan genis dinamik aralik
• Iki kat degisikligi hizla tanimlayabilmekte
• Spesifik erime egrisi analizleri ile spesifik
• amplifikasyonlarin tanimlanmasi
• Duyarliligi, özgüllügü ve tekrarlanabilirligi
  yüksek
• Konvensiyonel PCRdan daha pahali degil

24
Real-time PCRin dezavantajlari

• teknik donanim, alt yapi, beceri ve tecrübe
  gerektiriyor
• Yüksek ekipman ihtiyaci
• Ayni ve farkli laboratuvarlar arasinda sonuçlar
  arasi fakliliklar
• Standardizasyon problemi

25
Real-Time PCR

• Tüp içinde olusan fluorescence saptanir
• Amplifikasyon sirasinda saptama yapilir

26
(www)
27
Sik kullanilan Real-Time PCR Systemleri
28
(No Transcript)
29
BioRad iCycler
30
Corbett Research Rotor-Gene 3000
31
SmartCycler
32
MJ Research Chromo4
33
Idaho Technology Rapid Cycler
34
Roche LightTyper LightCycler
35
Stratagene
36
Stratagene
37
PCRin TEMEL FAZLARI

• Exponential Faz
• Linear Faz (yüksek farklilik)
• Plateu Faz (End-point)

38
(No Transcript)
39
Exponential Faz

• PCR ürün miktari her siklusta tam olarak iki kat
  artar
• Reaksiyon spesifik ve tamdir
• Reaksiyonun Etkinligi 100 dür
• Reaksiyonun tüm bilesenleri tazedir.

40
(No Transcript)
41
(No Transcript)
42
Linear Faz (yüksek farklilik)

• Reaksiyonun kompanenetleri tükenmeye baslar
• Reaksiyon yavaslar
• Olusan PCR ürünleri degrade olmaya baslar

43
(No Transcript)
44
Plateu Faz (End-point)

• Geleneksel PCR larda jel bazli tani
• Reaksiyon sonlanmakta
• Yeni PCR ürünü olusmamakta
• PCR ürünleri degrade olmasi artmakta

45
(No Transcript)
46
(No Transcript)
47
(No Transcript)
48
(No Transcript)
49
(No Transcript)
50
Floresan Prob Sistemleri

• Hidrolizasyon problar
• (TaqMan (PE Biosystem), Beacons, Scorpions)
• Hibridizasyon problar
• (Light Cycler (Roche)
• DNAya baglanan (binding) boyalar
• (SYBR Green)

51
(No Transcript)
52

• LightCycler sisteminin bir uygulamasinda
  yalnizca çift zincirli
• DNAya baglandiklarinda floresans veren boyalar
  (Cyber green I)
• kullanilarak, amlifikasyona bagli DNA artisi,
  ortaya çikan
• floresansin miktari ile ölçülmektedir. Primerin
  baglanmasini takiben
• gerçeklestirilen uzama asamasinda hedef DNAnin
  çift sarmal hale
• gelmesiyle DNAya baglanan cyber green miktari
  artmakta ve
• buna bagli olarak yayilan floresans miktarinda
  artis gözlenmektedir.

53
(No Transcript)
54
(No Transcript)
55
SYBR Green (çift zincirli DNA ya baglanmakta)

• çift zincirli DNA ya baglanmakta)
• çift zincirli DNA ya baglandiklari sürece
  floresan emisyonu olmakta
• Spesifik olmayan baglanmalar gerçeklesmekte
• yogun optimizasyona ihtiyaci yok

56
Taqman

• LightCyclerin diger bir uygulama sekli, hedefe
  özgül problar
• kullanmaktir. Burada problarla testin özgüllügü
  artirilmistir.
• Problardan biri 3 ucundan floresans boya ile
  isaretli (donör boya),
• digeri 5 ucundan alici boya (acceptor dye) ile
  isaretlenmistir.
• Problar hedef amplikonlar üzerinde birbirine
  yakin (1-5 nükleotit
• uzaklikta) yere baglanmakta ve isaretli uçlar yan
  yana gelmektedir.
• Iki boyanin yan yana gelmesiyle açiga çikan
  enerji ikinci prob
• üzerindeki alici boyayi etkileyerek floresans
  olusumuna yol
• açmaktadir. Fluoresance resonance energy
  transfer, (FRET)
• olarak adlandirilan bu enerji transferi sonucunda
  olusan floresans
• miktari, ortamdaki hibridizasyonun derecesine
  diger bir ifade ile
• PCR siklusu süresince olusan amplikonlarin
  miktarina bagli olarak
• artmaktadir.

57

• TaqMan sisteminde 5 ve 3 uçlarindan florokrom
  maddelerle isaretli prob kullanilmaktadir.
  Probun 5 ucunda raportör florokrom
  (6-carboxyfluorescein 6-FAM), 3 ucunda ise
  baskilayici florokrom (6-carboxy-tetramethyl-rhoda
  mine TAMRA) bulunmaktadir. Prob, tek sarmal hale
  getirilen hedef molekül üzerinde, primerlerin
  baglanma bölgesinin arasinda kalan yere baglanir.
  Prob-hedef molekül arasindaki hibridizasyon devam
  ettigi sürece raportör florokrom maddenin sinyal
  olusturmasi, 3 uçtaki baskilayici florokrom
  tarafindan engellenmektedir. Primerlerin hedef
  nükleik asite baglanmasini takiben baslatilan
  primer uzamasi probun baglandigi noktaya kadar
  geldiginde, sentezin devam edebilmesi için Taq
  DNA polimeraz enzimi 5?3 nükleaz aktivitesini
  kullanarak probu 5 uçtan yikmaya baslar. Böylece
  raportör florokrom serbest hale geçer ve sinyal
  olusturur (Sekil 5). Her siklusta üretilen
  amplikon miktarina paralel olarak sinyal siddeti
  de artmaktadir

58
TaqMan FRET
Fluorescent Resonant Energy Transfer
59
Nigel Walker, NIEHS (www)
60
(No Transcript)
61
Spesifite
TaqMan
Yüksek spesifiklik
SYBR Green
Düsük spesifite
62
Molecular Beacons
63
molecular beacons
real-time
real-time
real-time
real-time

64
Scorpion
65
(No Transcript)
66
Yeni Prob Sistemleri

• Peptide nucleic acids (PNAs)
• nükleikasit anologlari (Tm 15)
• Minor Groove Binding (MGB)
• Locked Nucleic acid (LNA)
• Oligonüklotid riboz anologlari

67
Threshold Cycle

• threshold cycle veya CT degeri DRn de önemli
  artisin oldugu ilk siklusu ifade eder

68
nedir CT?
69
DRn (Rn)- (Rn-)(normalize reporter signal)

• Rn Templatide içeren reaksiyona giren tüm
  komponentlerin floresan emisyonu
• Rn- negatif kontrolün (pasif Boya) ve
  reaksiyone olmayan örneklerin floresan emisyonu
• DRn Rn ve Rn- arasindaki fark olup CT
• Degerinin hesaplanmasinda kullanilan temel
  göstergedir

70
Nedir DRn?
Rn
Sample
?Rn
Threshold
Rn
-Rn
No Template Control
CT
0
10
20
30
40
cycle number
71
(www)
72
Geri (Revers) Transkripsiyon PCR

• RNA PCR olarak ta bilinen RT-PCR iki asamali olup
  RNAdan tamamlayici DNA sentezi (geri
  transkripsiyon) ve tamanlayici DNA(cDNA)nin da
  standart PCR yoluyla çogaltilmasi asamalarini
  kapsar.RT-PCR tek asamali bir reaksiyonla da
  gerçeklesebilir. T.thermophilus (Tth) DNA
  polimerazi gibi bazi polimerazlar mangan
  varliginda hem RNA hem de DNA kalip ipliklerini
  kullanabildiginden tüm islem ayni tüpte tek
  asamada yapilabilmektedir. RT-PCR, mRNA veya
  viral RNA miktarlarinin belirlenmesi ile RNA
  düzeyinde gen anlatiminda oldukça duyarli bir
  yöntemdir.

73
IN SITU PCR

• PCR ile ilgili çalismalarda diger önemli bir
  asama, lam üzerine tespit edilen enfekte hücrede
  bulunan mikroorganizmaya ait hedef DNAnin
  amplifikasyonu ve sonucun in situ hibridizasyon
  ile
• gösterilmesidir. Kisaca lam üzerine doku veya
  hücreler konduktan sonra, havada kurutulur ve
  105Cde 30 saniye bekletilir. Paraformaldehitli
  fosfat tamponlu tuzlu su (2lik) ile bir saat
  isleme alinir. 3 x 0.1 M PBS (Phosphate buffer
  saline) ile bir kere, 1 x 0.1 M PBS ile üç defa
  yikanir. Proteinaz K enzimi (5 µg/ml) ile 55Cde
  iki saat muamele edildikten sonra, 96Cde iki
  dakika tutularak Proteinaz K inaktive edilir.
• Lam su ile yikanir ve havada kurutulur. Sonra
  lamin üzerine amplifikasyon solüsyonu eklenir ve
  plastik kapakla kapatilir. Plastik kapagin etrafi
  oje ile çevrilir. Lam, otomatik termal cycler
  üzerine konulur. Aluminyum kagit ile
  kapatildiktan sonra amplifikasyon baslatilir.
  Amplifikasyondan sonra lam absolü etil alkol
  içinde 3-5 dakika tutulur. Sonra 92Cde 30
  saniye denatürasyon saglanir ve 2 x SSC (Sodyum
  klorür Sodyum sitrat)tamponu ile yikanir. Bunu
  takiben özgül problarla in situ hibridizasyon
  yapilarak amplifikasyon sonucu gözlenir

74
ÇALISMA RAPORU

• G-Aktin yapimi
• G-aktin tamponu hazirandi.
• - 5 mM K-Fosfat
• - 0,5 mM ATP
• - 0,1 mM CaCl2
• - 0,5 mM DTT
• - 1 mM NaN3
• Hazirlanan tamponun içinde Tavsanin çizgili kas
  hücrelerinden elde edilen lifler 4-5 saat
  manyetik karistiricida çözülür.
• Çözülen örnek Tülbent bezden süzüldükten sonra
  0,5 lik filtreden geçirildi.
• Elde edilen örneklerin hacmine göre 10 mM NaCl ve
  3 mM MgCl2 eklenerek gece polimerlesmeye
  birakildi.

75
Aktin Yapimi

• 5) Örnekler 80.000 x g de 4 saat santrafüj
  edildi.
• 6) Pelet alinir ve üzerine 2,5 ml depolimerlesme
  tamponu eklenir ve vortex ile pelet tampon içinde
  çözüldü.
• 7) 29.000 x g de 45 dakika santrifüj edilen
  örneklerden süpernatant alinir.
• 8) Alinan örnek G aktin tamponunda 4 saat dialize
  yatirilir.
• 9) Dializ edilen örnekler elektroforez yapilarak
  G-aktinin olusup olusmadigi gözlendi.

76
(No Transcript)
77
G-Aktin den F-Aktin eldesi

• Elde edilen aktine 10 mM NaCl ve 3 mM MgCl2
  eklenerek polimerlesmeye birakildi
• Polimerlesme sirasinda 0, 5, 10, 20, 60 dakilarda
  örnegin vizkoslugu ölçüldü.

78
Bakteriden EF-2 Eldesi

• 1. Daha önceden 180 C'de 2 saat kuru etüvde
  otoklavlanan cam kap içine 100 ml LS (50 ug/ml
  ampisilin) kondu. Bug'dan pipet ucuyla alinarak,
  100 ml LB (w/amp) içine kontamine edildi. Gece
  boyunca 37 C'de shakerda sallanmaya
  birakilacakdi.
• 2. Ertesi sabah önceden otoklavlanmis cam kaplar
  içine 500 ml LB (w/ampisilin) kondu. Gece boyunca
  çogalan bakterilerden her 500 ml'ye 1 ml gelecek
  sekilde konulduktan sonra 37 C'de shakerda
  sallanmaya birakildi.
• 3. Çogalan bakterinin yarim saatlik zaman
  dilimlerinde 600 nm'de OD degerleri ölçüldü. OD
  degeri 600 nm dalga boyunda 0,5 - 0,6 degerine
  ulasinca 0.1 mM olacak sekilde IPTG ve 20 ug/ml
  olacak sekilde 500 ml ampisilinli LB medyumu
  içerisine 2 ul chloroamphenicol eklendi. IPTG ve
  cloroamphenicol eklemeden hemen önce daha sonra
  poliakrilamid jelde kontrol edebilmek amaciyla 0.
  saat için 1 ml örnek alindi.
• 4. Shaker'da 25 C'de 4 saat boyunca inkübasyona
  birakildiktan sonra, 4. saatin sonunda
  poliakrilamid jelde kullanmak üzere 1 ml örnek
  alindi.
• 5. Buz içinde konulan veya santrifüj godelerine
  aktarilan bakteriler 3500 rpm'de 4 C'de 10 dakika
  boyunca santrifüj edilip bakterilerin çökmesini
  saglandiktan sonra 2 ml lyzis bufferda çözüldü.
• 6. Sonikatörde buz içindeyken 40-60 saniye kadar
  süt beyazi rengine olana dek tutulup daha sonra
  -20 C'ye kaldirildi.
• 7. Poliakrilamid jelde O. saat ve 4.saat için
  aldigin örnekleri yürütüp coommassie boyama
  yaparak protein elde edilip edilmedigini kontrol
  edildi.
• 8. istenen protein poliakrilamid jelde
  görüldükten sonra, pürüfikasyon asamasina
  geçildi.

79
(No Transcript)