Inducci

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Inducción de proteína recombinante

• b-Lactamasa

2
Tecnología de DNA recombinante Herramientas
3
Tecnología de DNA recombinante Herramientas
4
cDNA
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Inducción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se obtienen a partir
de una especie o una línea celular distinta a la
célula original.
Ventajas de expresar proteínas recombinantes en
bacterias fácil de cultivar fácil de
modificar genéticamente trabajo rápido alto
rendimiento 80 ahorro de
Retos de expresar genes de eucariontes en
bacteria.....
Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones
post-traduccionales .... depende de la
complejidad de la proteína
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Sistemas biológicos de producción de PR

• Bacterias
• E. coli
• B. subtilis
• Células eucariontes
• Hongos
• Levaduras
• Saccharomyces cerevisiae
• Pichia pastoris y otros metilotróficos
• Hongos filamentosos
• Células animales en cultivo
• Células de insecto en cultivo
• Plantas

Maximizar la expresión de proteínas codificadas
por genes clonados
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Clonación del DNA

• DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
• Vector de clonación (vehículo)
• Organismo huésped
• (E. coli)
• Selección de vectores

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Qué vector? pGEM pGEX Gatawey pET
Qué DNA? Organismo, tejido, fracción
sub-celular Análisis in silico de secuencia, ER
Qué huésped?
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Vector de clonación pET-24a()
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Selección de bacterias transformadas
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Vector de recombinación pET- TEM-1
7200 bp
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• Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una
  zona promotora y otra de paro de la transcripción

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(No Transcript)
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El sistema de expresión también debe tener las
siguientes características
Cromosoma de Escherichia coli
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Además el vector PET tiene la secuencia del
promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del
transgene
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Análogos de la lactosa
17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
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Procedimiento de proteína recombinante

• Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli
  transformado con vector, añadir a 15 mL de LB
• Incubar con agitación a 37 ? C hasta OD600
  0.6-0.8
• Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final)
• Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30
  min por 2 h.
• Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC,
  desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.

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Peculiaridades de la construcción

• En el vector pET-TEM se insertaron los genes que
  codifican para dos proteínas
• 1) ß-lactamasa
• 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en la
  membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del
  manual)
• Por lo tanto no se requiere la extracción de la
  ß-lactamasa, esta será secretada al medio tras su
  síntesis

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Purificación de la proteína recombinante
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Proteina GFP
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Purificación de la proteína recombinante
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RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO.
2h 1.5 h 1h 0
Después de la inducción