Title: Inducci
1Inducción de proteína recombinante
2Tecnología de DNA recombinante Herramientas
3Tecnología de DNA recombinante Herramientas
4cDNA
5Inducción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se obtienen a partir
de una especie o una línea celular distinta a la
célula original.
Ventajas de expresar proteínas recombinantes en
bacterias fácil de cultivar fácil de
modificar genéticamente trabajo rápido alto
rendimiento 80 ahorro de
Retos de expresar genes de eucariontes en
bacteria.....
Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones
post-raduccionales .... depende de la complejidad
de la proteína
6Sistemas biológicos de producción de PR
- Bacterias
- E. coli
- B. subtilis
- Células eucariontes
- Hongos
- Levaduras
- Saccharomyces cerevisiae
- Pichia pastoris y otros metilotróficos
- Hongos filamentosos
- Células animales en cultivo
- Células de insecto en cultivo
- Plantas
Maximizar la expresión de proteínas codificadas
por genes clonados
7Clonación del DNA
- DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
- Vector de clonación (vehículo)
- Organismo huésped
- (E. coli)
- Selección de vectores
8Vector de clonación pET-24a()
9Selección de bacterias transformadas
10Vector de recombinación pET- TEM-1
7200 bp
11- Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una
zona promotora y otra de paro de la transcripción
12(No Transcript)
13El sistema de expresión también debe tener las
siguientes características
Cromosoma de Escherichia coli
14Además el vector PET tiene la secuencia del
promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del
transgene
15Análogos de la lactosa
16(No Transcript)
17(No Transcript)
18Procedimiento de proteína recombinante
- Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli
transformado con vector, añadir a 15 mL de LB - Incubar con agitación a 37 ? C hasta OD600
0.6-0.8 - Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final)
- Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30
min por 2 h. - Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC,
desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.
19Peculiaridades de la construcción
- En el vector pET-TEM se insertaron los genes que
codifican para dos proteínas - 1) ß-lactamasa
- 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en la
membrana externa de las bacterias. (Pag 43 del
manual) - Por lo tanto no se requiere la extracción de la
ß-lactamasa, esta será secretada al medio tras su
síntesis
20Purificación de la proteína recombinante
21Proteina GFP
22Purificación de la proteína recombinante
23RESULTADOS DEL SEMESTRE PASADO
2h 1.5 h 1h 0
Después de la inducción