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Inducci

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Inducci n de prote na recombinante b-Lactamasa ... OmpA Prote na de tr nsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag 43 del manual) ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: Inducci


1
Inducción de proteína recombinante
  • b-Lactamasa

2
Tecnología de DNA recombinante Herramientas
3
Tecnología de DNA recombinante Herramientas
4
cDNA
5
Inducción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se obtienen a partir
de una especie o una línea celular distinta a la
célula original.
Ventajas de expresar proteínas recombinantes en
bacterias fácil de cultivar fácil de
modificar genéticamente trabajo rápido alto
rendimiento 80 ahorro de
Retos de expresar genes de eucariontes en
bacteria.....
Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones
post-raduccionales .... depende de la complejidad
de la proteína
6
Sistemas biológicos de producción de PR
  • Bacterias
  • E. coli
  • B. subtilis
  • Células eucariontes
  • Hongos
  • Levaduras
  • Saccharomyces cerevisiae
  • Pichia pastoris y otros metilotróficos
  • Hongos filamentosos
  • Células animales en cultivo
  • Células de insecto en cultivo
  • Plantas

Maximizar la expresión de proteínas codificadas
por genes clonados
7
Clonación del DNA
  • DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
  • Vector de clonación (vehículo)
  • Organismo huésped
  • (E. coli)
  • Selección de vectores

8
Vector de clonación pET-24a()
9
Selección de bacterias transformadas
10
Vector de recombinación pET- TEM-1
7200 bp
11
  • Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una
    zona promotora y otra de paro de la transcripción

12
(No Transcript)
13
El sistema de expresión también debe tener las
siguientes características
Cromosoma de Escherichia coli
14
Además el vector PET tiene la secuencia del
promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del
transgene
15
Análogos de la lactosa
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
Procedimiento de proteína recombinante
  • Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli
    transformado con vector, añadir a 15 mL de LB
  • Incubar con agitación a 37 ? C hasta OD600
    0.6-0.8
  • Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final)
  • Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30
    min por 2 h.
  • Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC,
    desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.

19
Peculiaridades de la construcción
  • En el vector pET-TEM se insertaron los genes que
    codifican para dos proteínas
  • 1) ß-lactamasa
  • 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en la
    membrana externa de las bacterias. (Pag 43 del
    manual)
  • Por lo tanto no se requiere la extracción de la
    ß-lactamasa, esta será secretada al medio tras su
    síntesis

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Purificación de la proteína recombinante
21
Proteina GFP
22
Purificación de la proteína recombinante
23
RESULTADOS DEL SEMESTRE PASADO
2h 1.5 h 1h 0
Después de la inducción
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