Detec

1
Detecção de ANA por imunofluorescência
2
Doenças Autoimunes

• Ehrlich horror autotoxicus
• Owens (1945) Apesar da partilha sanguinea os
  gémeos bi-vitelinos não se rejeitam tolerância
  imunológica ao gémeo
• Billingham (1953)
• transplantes em ratinhos adultos de estirpes
  diferentes são rejeitados
• transplantes em ratinhos neonatais de estirpes
  diferentes são aceites mesmo depois de atingirem
  a vida adulta
• Burnet (1956) Teoria da selecção clonal ou dos
  clones proibidos

3
Mecanismos de tolerância Imunológica

• Eliminação clonal
• Anergia Clonal
• Supressão da resposta imunitária (células T
  supressoras)
• Falha na apresentação antigénica
• Baixa expressão de HLA-II
• Tecidos imunológicamente privilegiados
• SNC (barreira hemato-encefálica)
• Testiculo (baixa temperatura)
• câmara anterior do olho (elevada TGFb)
• Rede idiotipo-antiidiotipo

4
Mecanismos de Indução de auto-imunidade (I)

• Falha de eliminação clonal
• Linfócitos B1(CD5)
• Alterações na apresentação antigénica
• Modificações dos autoantigénios
• Mimetismo molecular
• Expressão ectópica de HLA-II
• Rotura de anergia clonal
• IL-2
• Expressão defeituosa de faz
• Activação policlonal
• LPS
• Superantigénios

• Rotura de anergia clonal
• Falha da regulação da resposta imunológica
• Falha das células supressoras mantém uma resposta
  em actividade
• Regulação antiidiotipica
• reacção cruzada com anticorpo anti bacteriano
• Anticorpos mimetizando ligandos celulares,
  induzem respostas via receptores celulares
• Equilibrio Th1/Th2
• Regulação neuro-hormonal da resposta imunológica

5
Patologias autoimunes sistémicas e de órgão

• LES
• Lúpus discóide
• Esclerodermia
• Citopenias autoimunes
• Síndrome de Goodpasture
• Cirrose Biliar Primária
• Hepatite crónica activa
• Síndrome Guillain-Barré
• Uveite
• Fibrose Pulmonar Idiopát.

• Artrite reumatóide
• Artrite reumatóide juvenil
• Sindrome de Sjögren
• DMID (Diabetes )
• Psoriase
• Doença de Graves
• Doença de Hashimoto
• Esclerose Múltipla
• Colite ulcerosa
• Doença de Chron
• Miastenia Gravis

6
Rheumatoid Arthritis

• An autoimmune disorder affecting connective
  tissue.
• 3 million afflicted in US
• Afflicts women during menopause
• 48-52 years of age
• shorten life expectancy by 3-7 years
• Afflicts men women after 65 years of age
• shorten life expectancy by 7-10 years for men.
• Etiology
• Combination of factors including a genetic
  predisposition and triggered by unknown
  infectious agent (possibly EBV).

7
Clinical Manifestations

• Joint problems over time
• Occur symmetrically
• Alteration in the wrist
• Ulnar drift
• Boutonniere deformity
• Swan-neck deformity
• Rheumatoid nodules

8
EXAMPLE OF ARTHRITIS OF THE LEFT KNEE
9
Systemic Lupus Erythmatosus

• Chronic, inflammatory, autoimmune disorder
• 2 types discoid and systemic
• Etiology - unclear
• May be several risk factors - infection, exposure
  to UVB, environmental irritants

10
Systemic Lupus Erythmatosus

• Pathophysiology
• Produce autoantibodies due to defect in
  T-suppressor cells NK cells are also suppressed
• Autoantibodies - antinuclear antibodies (ANA)
• when cell dies, nuclei bind with ANA, forms
  immune complex that stimulates inflammatory
  response
• Immune complex also stimulates activation of
  complement

11
Discoid Lupus
12
Lupus
13
(No Transcript)
14
Malar Rash (Butterfly Rash)
Discoid Lesions a thick, disk-like rash that
scars, usually on sun-exposed areas
Arthritis inflammation of peripheral joints with
tenderness, swelling or effusion with skin changes
15
Pericarditis
Oral Ulcers
16
Diagnóstico de D. Autoimune (I)

• Provas directas
• Reprodução num recipiente normal por
  transferência de anticorpos
• Não aplicável ao Homem

• Provas indirectas
• Reprodução em animais
• por imunização com auto-antigénios
• Requer conhecimento do auto-antigénio
• Requer a administração de potentes adjuvantes
• Por transferência de Linfócitos para ratinhos
  SCID
• Identificação de auto-anticorpos ou células T
  auto-reactivas nos órgãos alvo

17
Diagnóstico de D. Autoimune (II)

• Provas circunstanciais
• Associação com outras doenças auto-imunes
• Infiltração linfocitica nos órgãos afectados
• Associação com determinados haplotipos HLA
• Detecção sérica de autoanticorpos
• Resposta favorável a imuno-supressores

18
(No Transcript)
19
Suggested Clinical and Laboratory Criteria
For The Diagnosis of Antiphospholipid
Syndrome
20
How is Lupus diagnosed?

• When a doctor thinks a patient may have Lupus, an
  ANA blood test is ordered.
• Other tests such as an anti-dsDNA, anti-Sm,
  anti-Ro/SS-A, and anti-RNP also may be ordered to
  determine if a patient has Lupus.
• Complement tests are performed to measure the
  amount of complement proteins circulating in the
  blood.

21
Diagnostic Studies

• ANAs are the best screening test
• Antibodies to double-stranded DNA (dsDNA) and to
  Sm are relatively specific for SLE
• Determining the complete autoantibody profile of
  each patient helps predict clinical subsets. High
  serum levels of ANAs and anti-dsDNA and low
  levels of complement usually reflect disease
  activity, especially in patients with nephritis

22
Algorithm for the diagnosis of SLE. ANA,
antinuclear antibody ACR, American College of
Rheumatology CTD, connective tissue disease
WBC, white blood cell count RBC, red blood cell
count, , recommended in initial evaluation.
23
Diagnóstico de D. Autoimune (II)

• Provas circunstanciais
• Associação com outras doenças auto-imunes
• Infiltração linfocitica nos órgãos afectados
• Associação com determinados haplotipos HLA
• Detecção sérica de autoanticorpos
• Resposta favorável a imuno-supressores

24
Doenças associadas a ANA
25
Auto-antigénios detectáveis com as células Hep-2
26
Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2
(II)

• Soro colhido fresco ou a 4ºC (1-2 semanas) ou a
  20ºC (periodos longos)
• Evitar ciclos congelar/descongelar
• Congelação pode concentrar o soro (liofilização)
• Testar diluições seriadas do soro em PBS (140,
  180, 1160,...) (semi-quantificação do título,
  melhores padrões, evitar falsos positivos )

27
Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2
(II)

• Láminas com as células Hep-2 em monocamada
  (vários poços/lâmina). Deixar as lâminas chegar a
  RT antes de abrir o pacote selado.
• Adicionar o soro diluído a testar, e incubar 30
  min em incubadora húmida a RT
• Lavar com PBS
• Adicionar o secundário (cabra, ovelha ou coelho)
  marcado com FITC, e incubar como acima
• Universal (anti IgH de IgG,IgM,IgA não
  purificado)
• Anti-IgG (as mais importantes p/ diagnóstico)
• Anti-IgM (SLE pediátrico)
• Lavar com PBS
• Contrastar com 1 a 2 gotas de Azul de Evans a 1
  por 100 mL PBS
• Lavar com PBS
• Montar em glicerol

28
Padrões Hep-2 (I)
29
Padrões Hep-2 (II)
30
Padrões Hep-2
31
Padrões gerais ANA (Nucleares)
32
Tipos de padrões Hep-2
33
Resolução de Problemas