SEPARA

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SEPARAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS
Há uma grande variedade de produtos
biotecnológicos, os quais podemos agrupar em três
principais categorias
Insumos químicos e biomoléculas
Álcoois Polímeros Ácidos orgânicos
Vitaminas Solventes Aminoácidos Antibióticos
Enzimas Hormônios Poliésteres
Enfoque do curso
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Alimentos

• Bebidas alcoólicas
• Leites fermentados
• Pão
• Queijos
• Vegetais fermentados
• Probióticos

Microrganismos
Inóculo para processos fermentativos Microrganismo
s fixadores de nitrogênio Microrganismos para
controle biológico Vacinas
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Exemplos de enzimas

• Protease de Bacillus Glicose oxidase
• Amilase de Bacillus Invertase
• Glicoamilase Lisozima
• Glicose-isomerase Penicilina acilase
• Renina microbiana Lactase
• ?-amilase Lipase
• Amilase fúngica Xilanase

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É importante observar a escala de aplicação dos
diversos métodos de separação e purificação de
produtos biotecnológicos

• Escala de laboratório, normalmente para produtos
  destinados a estudos acadêmicos e produtos de
  aplicações específicas
• Escala industrial, quando se busca a obtenção de
  grandes quantidades de produto para fins
  comerciais

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Outras observações

• Alguns procedimentos são viáveis apenas em
  laboratório

• O grau de pureza a ser atingido depende da
  aplicação a que se destina o produto

• Para a escolha das técnicas deve-se considerar o
  seu custo, o rendimento, a pureza desejada, a
  produtividade

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As etapas do processo fermentativo até o final da
fermentação são denominadas linha ascendente ou
up stream e a etapa de recuperação é chamada
linha descendente ou down stream

• Definição Separação do produto do meio
  fermentado, colocando-o na forma mais pura
  possível para a aplicação a que se destina.
• A etapa de recuperação de produto começa após a
  determinação correta do final da fermentação.
• Esta deve levar em conta o máximo da produção
  técnica e a máxima produção econômica.
• O produto de interesse pode estar no interior da
  célula ou no meio de fermentação.

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• Não existe um procedimento único de recuperação
  de produto,
• Cada processo apresenta suas peculiaridades
  devido às características específicas dos
  diferentes produtos e dos microrganismos.

Operações básicas 1. Rompimento celular (quando
o produto de interesse é intracelular) 2.
Separação das células ou fragmentos
(microrganismo) 3. Concentração 4. Separação do
produto propriamente dita
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• 1. Para liberar os produtos intracelulares a
  parede celular deve ser rompida.
• - Os métodos de rompimento podem ser
• Mecânicos - Moagem úmida
• - Homogeneização a alta pressão
• - Extrusão por pressão
• - Sonificação
• Não Mecânicos -Químico (ácidos, bases,
  solventes)
• -Físico (p.e. choque osmótico)
• -Enzimático (p.e. enzimas de lise)
• - Etapa utilizada sobretudo para recuperação de
  proteínas e enzimas.

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• 2. Emprega as operações unitárias de separação
  sólido-líquido
• Principais Operações - Centrifugação
• - Filtração
• princípio de separação diferença de densidade
  (também tamanho de partícula e viscosidade)
• Principais tipos de centrífuga - tubular (a)
• - câmara (b)
• - disco (c)
• - rolo (d)

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• Obs. Ultracentrífugas operam descontinuamente e
  normalmente têm baixa capacidade de processamento
• O fluxo volumétrico de alimentação para uma
  centrífuga pode ser determinado pela expressão

Q d2 .?? . g. ?. A 18 ?
Onde Q é o fluxo volumétrico de alimentação ??
é a diferença de densidade (dens. Sólido dens.
do líquido) g é a aceleração da gravidade d é o
diâmetro da partícula ? é o fator de aceleração A
é o equivalente de área do rotor ? é a
viscosidade dinâmica do líquido
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• Fatores de aceleração das centrífugas mais comuns
• Ultracentrífugas 105
  106 x g
• Centrífugas tubulares 13000
  17000 x g
• Centrífugas de câmara 6000 - 11000
  x g
• Centrífugas de disco 5000 -
  15000 x g
• Centrífugas de rolo 1500
  4500 x g
• Critério para ampliação Fator de aceleração .
  tempo gt ?. t
• Se uma separação satisfatória é atingida com
  3000xg durante 5 minutos, o mesmo resultado pode
  ser alcançado com 1500xg e 10 minutos, em escala
  industrial.
• Avaliação da centrifugação compactação do
  sedimento e turbidez do sobrenadante

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• Exemplo de aplicação para centrífuga
• Uma determinada indústria apresenta uma produção
  de meio fermentado igual a 180 m3/dia.
  Considerando as características do meio e da
  centrífuga a ser empregada, quantas unidades
  deste equipamento você solicitaria ao
  departamento de compras da empresa, de modo a
  garantir a separação das células do meio de
  fermentação, sem risco de parar a produção?
• Dados Densidade do sólido 900 kg/m3
• Densidade do líquido 1000 kg/m3
• Diâmetro da partícula 0,01 mm fator de
  aceleração 8000
• Equivalente de área 0,10 m2 visc.do líquido
  10-2 kg/m.s
•   
• Q d2 . ?? . g . ? . A
• 18 . ?

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• Princípio de separação tamanho da partícula
  (também forma e compressibilidade do material).
• A suspensão, sob pressão, é perpendicularmente
  direcionada a um meio filtrante (filtração
  convencional).
• Aplica-se a suspensões diluídas de células.
• A fração volumétrica que atravessa o meio
  filtrante é denominada filtrado e da deposição
  contínua das células sobre o meio filtrante
  resulta a formação de uma torta de filtração.
• Ao contrário da centrifugação, a filtração não
  depende da diferença de densidade.
• Alguns tipos de filtro 1. Rotatório (mais
  adequado para meios biológicos, pois não é
  afetado pela compressibilidade da torta)
• 2. De pressão
• 3. Folha (disco) horizontal

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Fatores que influenciam a velocidade de filtração

• - permeabilidade de leito (K)
• - área de filtração (A)
• - viscosidade do líquido (?)
• - espessura do leito (L)
• - resistência do leito de filtração (L/K)
• - compressibilidade da torta (S)
• - concentração celular do líquido (X)
• - diferença de pressão através do leito (?P)
• - const. relacionada a tamanho e forma das
  células (?)

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O tempo (t) necessário para a filtração de um
volume V de suspensão contendo células sujeitas à
compres-sibilidade, sob uma determinada pressão e
através de uma área A é dado por

• ? . ? . X V2
• 2 . ?P(1-S) A2

t
Obs. - S varia de 0 a 1,0 - Tortas de
células microbianas podem ter S de até 0,8
- Para tortas rígidas, S 0
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Filtração tangencial

• Microfiltração na qual o meio escoa
  tangencialmente à superfície do material
  filtrante
• Seu desempenho é caracterizado por duas
  variáveis fluxo de filtrado e coeficiente de
  retenção de sólidos em suspensão ou solutos. O
  fluxo de filtrado (J) varia de 50 a 100 L/h.m2 e
  é definido por

J Qf / A
Onde Qf é a vazão de filtrado (L/h) A é a área
da membrana (m2)
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O coeficiente de retenção (R) é dado por

• R 1 (Cf / Cr)

Onde Cf é a concentração de solutos ou sólidos
no filtrado Cr é a concentração de solutos ou
sólidos no retido

• Fatores importantes
• Concentração de polarização
• Entupimento (fouling)

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Para reverter os efeitos da concentração de
polarização pode-se alterar condições de operação
como aumento da velocidade tangencial, aumento
da pressão e variação do pH

• Para minimizar os efeitos da concentração de
  polarização e do fouling podem-se empregar uma
  velocidade de escoamento entre 0,2 e 0,5 m/s
  (para filtros de placas) e 2 a 5 m/s (para
  filtros tubulares) e uma pressão transmembrana
  (PTM) entre 100 e 500 kPa.

A velocidade é dada por ve ?a / At
Onde ?a é a vazão de alimentação (m3/h) At é a
área transversal do canal de escoamento da
suspensão (m2)
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A pressão transmembrana é dada por

• PTM (Pa Pr) - Pf
• 2

Onde Pa é a pressão de alimentação (N/m2) Pr é a
pressão do retido (N/m2) Pf é a pressão do
filtrado (N/m2)
Os dois fenômenos citados mais a resistência da
própria membrana de filtração aumentam a
resistência à passagem do fluxo de filtrado,
sendo este, portanto, representado por
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• PTM
• ? (Rm Rcp Rf)

J
Onde ? é a viscosidade do fluido de
alimentação Rm é a resistência da membrana
Rcp é a resistência devido à conc. de
polarização Rf é a resistência devido ao
fouling
- A variáveis do processo são as mesmas em
qualquer escala. - Após a definição da PTM, da
velocidade de escoamento e da capacidade de
filtração (J), a ampliação de escala é feita em
função do volume a ser processado.
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• 3. A concentração de vários produtos de
  fermentação deve ser aumentada para que o
  processo de separação propriamente dito seja
  viável técnica e economicamente. Normalmente esta
  etapa é realizada em concentradores à vácuo, que
  permitem a evaporação à baixas temperaturas,
  evitando danos ao produto.
• 4. A separação do produto é feita por
  precipitação e/ou cristalização, seguidas de
  centrifugação e secagem, para produtos obtidos na
  forma sólida.

Para produtos na forma líquida utiliza-se a
destilação, extração líquido-líquido e
salting-out, entre outras.
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Esquema geral do processo fermentativo

• Preparo do meio
• tratamento da matéria-prima
• mistura de nutrientes
• ajuste de pH
• tratamento térmico

Preparo de inóculo (microrganismo)
Fermentação propriamente dita (BIORREATOR)
Linha descendente
Linha ascendente
Processos à jusante
Processos à montante
Recuperação do produto
downstream
upstream
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• HOMOGENEIZADOR DE ALTA PRESSÁO
•  
• Corpo fixo
•  
• Suspensão
  pressão
  
  
• de células
•  
•  
• Anel de impacto
•  
•  
•  
•  

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• ESQUEMA SIMPLIFICADO DE DIFERENTES ENVOLTÓRIOS
  CELULARES
• Bactéria Gram () Peptidoglicano
• 
  Membrana
• 
  citoplasmática
• Bactéria Gram ( )
  Membrana externa
• 
  Peptidoglicano
• Membrana
• 
  citoplasmática

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• Leveduras Manana com pontes de
• 
  fosfodiéster
•  
  Glicano com proteina
• Membrana
• 
  citoplasmática
• Fungos Alfa e beta-glicanos
• Camada glicoproteica
• Quitina/microfibrilas
• Membrana
• 
  citoplasmática
•  

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Recuperação
1- Destilação 2- Extração líquido-líquido 3-
Salting-out 4- Conversão no próprio meio
1- Filtração, concentração, evaporação e
condensação 2- Filtração, concentração, extração
(butanol, éter dietílico, álcool butílico) 3-
Filtração, adição do sal, separação de fases 4-
Filtração, reações químicas (transformação no
produto de interesse), extração
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(No Transcript)