Cromatograf

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Cromatografía de líquidos de alta resolución HPLC
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Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?

• La cromatografía de líquidos de alta resolución,
  es un modo de cromatografía en la cual el
  proceso de separación y transferencia de masa es
  entre la fase estacionaria y la fase móvil y
  una temperatura dada.

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• La HPLC, representa una de las herramientas más
  empleadas en el laboratorio analítico moderno.
• La cromatografía es un método, usado
  primariamente para la separación de los
  componentes de una muestra, en la cual los
  componentes se distribuyen en dos fases.

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Diferencias. Fase Móvil

• Si es un gas Modalidad cromatográfica gaseosa.
• Si es un líquido Cromatografía líquida.
• Cromatografía en capa delgada.
• Cromatografía líquida en columna abierta.
• HPLC.

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Diferencias

• HPLC y GC Tipo de detectores y la influencia de
  la fase móvil.
• GC se utiliza para separar mezclas que contienen
  compuestos orgánicos volátiles.
• En GC es muy simple encontrar detectores que
  diferencien la muestra de la fase móvil.
• En HPLC es más difícil ya que la fase móvil no
  sólo no es inerte sino que su masa es
  sensiblemente superior.

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Clasificación de la Cromatografía de Líquidos

• Cromatografía Líquido-Sólido.(adsorción)
• Cromatografía Líquido-Líquido.(partición)
• Cromatografía de Fase (normal y reversa)
• Cromatografía de Intercambio iónico.
• Cromatografía de Exclusión por Tamaño
  (cromatografía en gel)

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Fase Estacionaria

• Si la fase estacionaria es un sólido y la fase
  móvil un líquido la Cromatografía se denomina
  CLS.
• Análogamente existirán una cromatografía CLL, CGL
  y CG.
• Así, la Cromatografía puede clasificarse en
  modalidades de afinidad y por tamaño molecular.

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Clasificación por Afinidad

• Cromatografía en fase normal.
• Cromatografía en fase ligada.
• Cromatografía de intercambio iónico.

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De Fase Ligada

• Reemplazando el tipo común de unión de la fase
  estacionaria a su soporte, haciéndola perdurable
  por medio de una unión química covalente.
• Ahora las separaciones se efectúan sobre material
  químicamente modificado, con un amplio rango de
  polaridad y selectividad.

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Intercambio iónico

• Se emplean rellenos en los cuales la partícula
  está constituida por un polímero o por sílica
  gel, en cada caso unida a un grupo funcional
  aniónico o catiónico.

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Exclusión por Tamaño

• Emplea materiales de porosidad controlada, que
  funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las
  moléculas de la muestra según un orden
  decreciente de tamaño molecular.
• Si se dispone de estándares apropiados, de peso
  molecular adecuado, puede evaluarse el PM de un
  compuesto desconocido.

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• Equipos

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Clasificación de Equipos

• Integrados Cada una de sus partes están reunidas
  en un gabinete y su intercambio o conexión con
  otros componentes es difícil.
• Modulares Los módulos son instrumentos
  individuales que permiten no solo armar el equipo
  según las necesidades, sino aumentar su
  complejidad según esa necesidad varíe.

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Componentes principales

• Solvente
• Bomba de alta presión
• Inyector
• Columna
• Detector
• Graficador

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Partes del cromatógrafo

• En el caso más simple, el cromatógrafo líquido
  está constituido por
• Un reservorio de solvente que alimenta al sistema
  con la fase móvil.
• Un sistema para forzar el pasaje de la muestra
  por la columna Bomba.
• Un sistema que permite la introducción de la
  muestra Inyector.
• Un sistema de monitoreo de la solución que emerge
  de la columna Detector.
• Un sistema de registro de los datos proveniente
  del detector.

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Diagrama Básico de un sistema de HPLC
17
Esquema
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(No Transcript)
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Bases de la separación

• Cuando la fase móvil y la muestra son forzadas a
  atravesar la fase estacionaria, se presentan
  diferentes tipos de interacciones hidrofóbicas,
  puentes de Hidrógeno, interacciones dipolares y
  electrostáticas, éstas son responsables de la
  mayor o menor afinidad de cada uno de los
  componentes de la muestra por alguna de las fases.

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Separación
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Figura, 41 Explicar
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• La eficiencia de una columna cromatográfica y,
  por lo tanto, su poder separativo se mide en
  función de su número de platos teóricos.
• Para lograr la separación de dos componentes
  dados, no sólo deben eluir a distintos tiempos de
  retención, sino que el ancho de los picos debe
  ser tan bajo como sea posible.

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• Aspectos técnicos

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Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?

• HPLC utiliza una fase móvil líquida para
  separar los componentes de la mezcla. El solvente
  trabaja a una presión de 6,000 psig
• Los componentes o analitos deben ser disueltos en
  un solvente y se pasan por la columna
  cromatográfica a altas presiones.
• La resolución depende de la interacción entre el
  soluto , los componentes y la fase estacionaria.

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Elección del Solvente

• Características
• Disponible comercialmente
• Precio
• Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos
  con productos de calidad de pureza
  cromatográfica. Bajo contenido de impurezas.
• Disolver la muestra
• Miscible con otros solventes para formar mezclas
  útiles

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Eleccción del Solvente

• Características
• No degradar o disolver la fase estacionaria
• Tener baja viscosidad para reducir las caídas de
  presión
• Ser compatible con el detector utilizado.
  Transparencia óptica (cuando se usan detectores
  UV)
• Se prefieren solventes de punto de ebullición
  intermedio.

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Tipos de solvente
Name MW BP I.R. UV Viscosidad µ
    C   nm cP Debye
Acetonitrile 41 82 1.341 195 .358 3.37
Dioxane 88 101 1.421 215 1.26 0.45
Ethanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68
Methanol 32 65 1.326 205 .584 1.66
Isopropanol 60 82 1.375 205 2.39 1.68
Tetrahydrofuran 72 66 1.404 215 2.20 1.70
Water 18 100 1.333 185 1.00 1.84
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Filtración y Desgasificación de solventes

• Las partículas pueden ocasionar costosos daños a
  la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general
  causar desgaste del sistema de HPLC. Los
  fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta
  este problema y recomiendan que se filtre ( 0.45
  o 0.22 micras) y desgasifique los solventes HPLC
  antes de usarlos.

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Filtración y Desgasificación de solventes

• El Oxígeno Disuelto puede producir mayor
  interferencia en los detectores de fluorescencia
  y electroquímicos.
• El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de
  la atmósfera que puede producir burbujas en la
  columna de HPLC y cuando el solvente entra al
  detector produce picos falsos y desviaciones de
  la línea base.
• El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces
  puede ser la causa de los cambios de pH en el
  sistema de solvente

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Métodos de Filtración de Solventes en HPLC

• Hay tres(3) métodos comunes que se utilizan hoy
  para la filtración previa de los Solventes en
  HPLC
• Filtro a la Entrada del Solvente
• Filtración al Vacío
• Filtración en Línea

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Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC

• Existen cuatro métodos comunes usados para
  desgasificar solventes en HPLC previos a su uso
• Sonificación
• Burbujear Helio
• Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo
  
• Desgasificación al Vacío en Línea
• Temperatura

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Preparación de fase móvil

• Ajuste de pH, parámetro critico en la retención
  de solutos ionizables ( medir antes de dosificar
  modificador orgánico)
• El pH de la solución aumenta con la
  incorporación de un modificador orgánico.
• A valores pH mayores de 7.5 disolución de sílice
  ( sangrado)
• A pH menor a 2 se hidroliza la unión entre la
  sílice y la fase enlazada.

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Bombas

• Requisitos o aspectos más importantes que debe
  reunir una bomba o sistema de bombeo
• Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
• Mantener el flujo libre de pulsaciones
• Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10
  ml/min).

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Bombas

• Control y reproducibilidad del flujo de solvente
• Componentes de la bomba resistentes a la
  corrosión

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Bombas

• Las bombas que se usan en HPLC se pueden
  clasificar según su funcionamiento y diseño en
• Mecánicas
• Recíprocantes
• De desplazamiento contínuo
• Neumáticas

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Bombas
Principio de la bomba reciprocante
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Bomba w 600

• Velocidad de flujo (0.01 a 0.5 ml/min, 0.1 y
  mayores con presión de 0 hasta 6000 psi
• Exactitud de flujo 0.5 /- 1.0
• Precisión /- 0.1 a 0.3
• Ruido pulsaciones en intervalos de tiempo
• Deriva cambios en intervalos de tiempo

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Programación del Solvente

• Existen dos métodos de programación de Solvente
  en HPLC
• Isocrático
• Gradiente de Elución. Es un término que se
  utiliza para describir el proceso mediante el
  cual se cambia la composición de la fase móvil.
  Pueden efectuarse de dos maneras
• A baja presión
• A alta presión

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(No Transcript)
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Sistemas de Inyección de muestra

• Estos sistemas han variados durante la historia
  del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba
  la inyección de la muestra con jeringas de alta
  presión cuales ya están de desuso. Hoy se utiliza
  el sistema de Válvulas inyectoras

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Sistemas de Inyección de muestra

• Generalmente se usa una válvula muestreadora con
  jeringa.

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• Válvula muestreadora

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Columna

• Actualmente todas las columnas son de acero
  inoxidable 316 con diámetro interno de 2.6 a 3
  mm o 4.6 a 5 mm , casi todas con un diámetro
  externo de ¼ de pulgada

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Fase estacionaria

• Principales parámetros de la fase estacionaria
• Tamaño de partícula 3 a 10 µm
• Distribución de partícula con una desviación
  máxima del 10
• Tamaño de poro 70 a 300 Å
• Área superficial 50 a 250 m2/g
• Densidad de la fase (numero de sitios activos por
  unidad de área) 1 a 5 por 1 nm2

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La tabla que se muestra presenta los parámetros
principales de algunos adsorbentes comerciales
Nombre Vporo Dporo Área Sup. Distribución de partícula densidad de la fase
  ml/g Å m2/g µM/m2
IB-Sil Phen. 0.75 125 165 5.5 2.74
Hypersil C4 (3) 0.6 300 50 2.0 4.80
Supelcosil C8 (3) 0.6 100 170 8.5 -
Spherisorb C8 0.5 80 220 6.0 2.51
Novapak C18 0.3 60 120 7.0 3.0
IB-Sil C18 0.75 125 165 11.0 3.27
Spherisorb C18 0.5 80 220 12.0 2.72
Prodigy C18 1.17 150 310 18.7 3.30
Inertsil C18 1.1 150 320 18.5 3.23
Hypersil C8 0.7 120 170 7.0 3.85
Hypersil C18 (3) 0.7 120 170 10.0 2.84
Selectosil C18 0.9 300 110 7.0 2.93
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Columna

• Fuentes de daño de una columna de HPLC
• Obstrucción por partículas pequeñas en los
  solventes o fases móviles
• Obstrucción por materiales no eluídos en las
  muestras
• Variación de las características de retención
  por incremento de materiales no eluídos

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Detectores
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Detección

• La eficiencia de un detector cromatográfico
  depende de la relación entre la cantidad física
  medida y la composición del efluente, así como
  también de las características de las señal de
  transferida.
• Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en
• Detectores basados en una propiedad de la fase
  móvil . Ejemplo Detector de Indice de Refracción
  
• Detectores basados en una propiedad de la
  sustancia a separar.
• Ejemplo Detector de Fluorescencia, Detector
  Ultravioleta

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Detección

• Detector UV. Hay básicamente tres tipos
• Detector de Longitud de Onda Fija
• Detector de Longitud de Onda Variable
• Detector de Arreglo de Diodos

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Detección

• Detector UV. Hay básicamente tres tipos
• Detector de Longitud de Onda Fija
• El espectro se divide en
• infrarrojo (IR) 2,500 - 50,000
• Infrarrojo cercano 800 - 2,500
• Visible 400 - 800
• Ultravioleta (UV) 190 - 400 nm

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Detección

• Detector de Índice de Refracción. Existen muchos
  diseños de estos detectores, pero solamente
  existen ahora dos tipos
• Tipo Deflexión
• Tipo Fresnel

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Detección

• Detector de Fluorescencia.
• Este detector solamente puede detectar compuestos
  que tengan fluorescencia nativa o inducida por
  derivatización .
• Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
• Según la Fuente de Excitación
• Según el sistema óptico

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Catálogo

• Revisar catalogo
• Preparación de la muestra
• Características de columnas
• Aplicaciones especificas

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Problemas más comunes encontrados en HPLC

• Esta es una lista de los problemas normalmente
  encontrados en HPLC, sus posibles causas
  posibles, y cómo solucionarlos.
• Presión Alta
• Posible causa Obstrucción de la Columna de HPLC
  o Guarda Columna por partículas.
• Solución Invierta la Columna y Enjuagar con
  solvente, teniendo la columna desconectada del
  detector. Si esto no funciona reemplace el
  fritado a la entrada de la columna. Si la presión
  sigue alta reemplace la columna.
• Solución a largo plazo Asegurase que todas las
  fases móviles se filtren apropiadamente antes que
  entren a la bomba de HPLC . También filtre todas
  las muestras antes de inyectarlas.

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Problemas más comunes encontrados en HPLC

• Pérdida de la Resolución
• Posible causa Obstrucción de la Columna de HPLC
  ó del Guarda Columna por partículas.
• Solución vea la sección de Presión Alta
• Solución a largo plazo Filtrar todo antes de que
  se introduzcan las fases móviles en el sistema de
  HPLC.

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Problemas más comunes encontrados en HPLC

• Picos Hendidos
• Posible causa Obstrucción de la Columna de HPLC
  o del Guarda Columna por partículas.
• Solución La columna se desatornilla. Si es
  necesario reemplazar la columna.
• Solución a largo plazo Filtrar todo antes que se
  introduzcan las fases móviles en el sistema de
  HPLC.

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Problemas más comunes encontrados en HPLC

• Variación en los Tiempos de Retención
• Posible causa Aire atrapado en la bomba debido
  a gases disueltos en fase móvil.
• Solución Degasificación de la Bomba
• Solución a larga plazo Asegurase fase móvil
  este propiamente y adecuadamente desgasificada.
  Si usa desgasificación electrónica en la línea
  asegurarse de que la cadencia del flujo no es
  demasiado alto.

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Problemas más comunes encontrados en HPLC

• Variaciones de la Línea Base
• Posible causa Burbujas del aire atrapados en la
  celda del detector debido a una mala
  desgasificación de los solventes de la fase
  móvil.
• Solución Asegurese que todas las fases móviles
  estén debidamente desgasificadas y considerar el
  uso de un restrictor de la presión a toma de
  corriente del detector.

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Problemas más comunes encontrados en HPLC

• Línea Base con mucho Ruido
• Posible causa Aire atrapado en celda del
  detector o en la bomba.
• Solución Enjuage el sistema y purge la bomba de
  HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente
  para mantener constante la velocidad de flujo de
  la fase móvil del sistema.

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Problemas más comunes encontrados en HPLC

• Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de
  Fluorescencia)
• Posible causa Oxígeno Disuelto
• Solución Desgasificar adecuadamente las fases
  móviles para reducir la concentración de oxígeno
  disuelto.
• Solución a largo plazo Agregar un sistema de
  filtración al vacío en línea. Periódicamente
  chequear el nivel de oxígeno disuelto.

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Problemas más comunes encontrados en HPLC

• Baja ó Ninguna Presión
• Posible causa Trabajar con bombas, sellos ó
  pistones expuestos por mucho tiempo a partículas
  en suspensión en la fase móvil.
• Solución Reemplace los sellos o pistones, si es
  necesario.