D

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Détermination de la concentration en protéines
par dosages colorimétriques
Il est souvent nécessaire de connaître la
concentration totale en protéines dun milieu.
ex  pour suivre les différentes étapes dune
purification.
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1. Les protéines
Définition? Les protéines sont constituées dun
enchaînement de plus dacides aminés reliés par
des liaisons peptidiques.
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• Acides aminés (aa) 
• Unité de base des protides (monomère).
• Comme leur nom lindique, ils sont constitués
• - dune fonction acide (COOH)
• et dune fonction amine (NH2).
• Leur nom varie selon le radical R. Il sont non
  hydrolysable.
• Parmi les 20 aa, 8 aa sont dits indispensables.

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Les monomères Acides aminées
Petits polymères de 2 à 100 aa Peptides
Polymères de plus de 100 aa Protéines
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Les liaisons peptidiques
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De nombreuses méthodes ont été mises au point
pour doser les protéines. généralement
méthodes spectrophotométriques basées sur
diverses caractéristiques spectrales ou
réactionnelles des acides aminés constituant les
protéines.
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• choix méthode dépend des besoins et des
  caractéristiques recherchées
• spécificité,
• fiabilité,
• sensibilité,
• facilité de mise en œuvre,
• rapidité,
• coût,
• taille des échantillons,
• possibilité de récupérer l'échantillon après
  dosage,
• présence de substances interférentes dans
  l'échantillon,
• automatisation possible ou non etc.

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2. Principe d'une gamme étalon et d'une droite
détalonnage

• On utilise trois types de solution
• une solution de concentration connue d'une
  protéine
• référence ou standard par rapport à la protéine
  à doser.
• une solution de la protéine à doser
• dont on veut déterminer la concentration
  échantillon à doser (essai)
• une solution de réactif
• qui développe une coloration en réagissant avec
  des acides aminés spécifiques de ces protéines.

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La solution de concentration connue permet de
constituer une gamme étalon série de tubes qui
contiennent un volume final identique mais des
quantités croissantes et connues de la protéine
de référence.
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En même temps, une série de tubes, contenant
différents volumes de prise d'essai de la
protéine à doser, est préparée.
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La solution de réactif est ajoutée au même moment
dans tous les tubes afin que la coloration se
développe dans les mêmes conditions pour la gamme
étalon et l'échantillon à doser.expliquer autre
possibilité
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On laisse réagir dans les conditions et le temps
nécessaires puis on mesure l'absorbance de tous
les tubes.
A partir des tubes de la gamme étalon on trace
une courbe détalonnage absorbance f
(quantité protéine par tube) ou f (concentration
en protéines par tube)
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Cette proportionnalité permet de déterminer la
quantité de protéine contenue dans un volume de
prise d'essai de l'échantillon à doser. sans
oublier les facteurs de dilution
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3. Méthodes colorimétriques les plus courantes
pour la détermination de la concentration en
protéines

• Méthode du Biuret
• - Méthode de Folin-Lowry et coll (1951)
• modifiée par Peterson (1977)
• - Méthode de Bradford au bleu de Coomassie

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Au cours de 3 séances de TP que nous allons
réaliser ensemble nous allons tester les
différentes méthodes photométriques et nous
comparerons leurs critères de praticabilité dont
la sensibilité. Nous allons commencer par la
réaction dite  au biuret   Rappel cours 
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Principe Les ions cuivriques (Cu2) en milieu
fortement alcalin forment des complexes avec les
atomes dazote des groupements peptidiques gt
coloration violet avec peptides et protéines
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Consignes 

• En entête du compte rendu 
• titre
• date
• matériel utilisé (matière dœuvre)
• liste des réactifs utilisés avec pictogrammes de
  sécurité et mesure de sécurité à prendre 
• rechercher les pictogrammes de sécurité et mesure
  de sécurité sur bouquin  aldrich, sigma
  Internet  inrs, si vous trouver les sigles de
  lancienne et de la nouvelle nomenclature les
  retranscrire tous les deux dans le cahier.

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• 1ère séance on vous donne le tableau résumé
  de protocole
• puis progressivement, vous allez devoir élaborer
  par vous même le tableau à partir du protocole.
• Explication du tableau de manipulation  sens de
  lecture colonne et ligne et chronologie de la
  réalisation

Tube gamme étalon 0 1 2 3 4 5
réactif de Gornall (mL) 2 2 2 2 2 2
eau physiologique (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
étalon SAB 10 g/L (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
volume total (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante.
masse de protéines par tube (mg) 0 1 2 3 4 5
protéines dans le tube (mg/mL)
absorbance à 545 nm (A545)
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Tube gamme étalon 0 1 2 3 4 5
réactif de Gornall (mL) 2 2 2 2 2 2
eau physiologique (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
étalon SAB 10 g/L (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
volume total (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante.
masse de protéines par tube (mg) 0 1 2 3 4 5
protéines dans le tube (mg/mL)
absorbance à 545 nm (A545)

• Pourquoi ajout du réactif ou de la solution prot
  connue et essai en dernier ?
• car ils déclenchent la réaction de coloration
• Reconstituer le tableau SAB/EB dans un seul
  tableau. Pourquoi ?
• car on traite tous les échantillons 
  gamme/étalons et essais dans les mêmes conditions
  et en même temps (répétabilité optimale)

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• Rappelez moi les principales étapes de la
  réalisation dune dilution en fiole jaugée ?
• Remplir la fiole jaugée propre et sèche au ¾ avec
  le diluant
• attention de pas se tromper  eau physiologique
  ou avec Brij35à 0,01 (v/v)
• Ajouter le volume prélevé avec la P5000 dans la
  fiole
• Homogénéiser ? attention SAB protéine donc
  formation de mousse
• Ajouter du diluant jusquà 1cm du trait de jauge
  tout en rinçant les parois de la fiole
• Ajuster le volume au trait de jauge avec une
  pasteurette en plastique (bas du ménisque sur le
  trait de jauge)
• Fermer lorifice de la fiole avec du papier film
  étirable
• Homogénéiser par retournement

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• Quelle précaution doit on prendre pour délivrer
  un liquide dans un tube?
• Faire toucher la pointe du cône sur la paroi du
  tube incliné à 45C, pipette toujours tenue
  droite
• Conseils réalisation gamme
• Décaler les tubes dans le portoir après chaque
  ajout
• Vérifier le niveau équivalent dans les tubes
  quand on a atteint le volume total
• A la fin vérifier que la couleur des essais se
  situe à lœil dans la gamme
• Avant de commencer la manipulation  me montrer ?
• le tableau complété
• les Formules Littérales (FL)
• les Applications Numériques (AN)
• pour les calculs du tableau.

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• Exploitation des résultats 
• Faire un tableau de données obtenues  avec
  valeurs courbe étalonnage valeurs essais
• Déterminer la masse de prot/tube pour les essais
  (EB)
• Calculer la prot dans EB
• Faire apparaître dans le layout sur Igor  toutes
  les formules et calculs
• Exprimer les résultats avec les écarts types dans
  le compte rendu

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• Expression des résultats 
• Avec les règles de métrologie  écart type de
  répétabilité Sr 0.4 g/L
• Attention au nombre de chiffres significatifs
  après la virgule, comment exprimez vous les
  résultats? En fonction de quoi?
• en fonction du Sr si il est donné avec 4 chiffres
  après la virgule, il faut exprimer le résultat
  avec 4 chiffres après la virgule
• Comment peut on savoir si on peut faire la
  moyenne des résultats obtenus pour les essais ?
• moyenne possible si ?E1-E2? ? à 2.8 x Sr (écart
  type de répétabilité)
• bien remplir les fiches de vie du matériel,
  préciser le nom et n du spectro, le n des
  pipettes utilisées
• Attente en fin de TP biuret  CR entier
  tableau 2ème séance de TP folin lowry à valider

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Questions supplémentaires
25
Questions supplémentairesréponse attendue dans CR

• connaissant la EB par la mesure à 280 nm,
  pourquoi doit-on le diluer au 1/5 dans cette
  technique ?
• Justifier la couleur du tube 0 de la gamme
  étalon