Marcatori proteici

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Marcatori Molecolari

• Introduzione
• Marcatori proteici
• DNA
• Marcatori RFLP
• PCR

• Marcatori RAPD
• Marcatori STS
• Marcatori AFLP
• Tecniche elettroforesi
• Considerazioni

• Applicazioni

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Introduzione

• I fattori ambientali possono influenzare i
  caratteri morfologici
• I marcatori molecolari (MM) focalizzano la
  diversità del materiale genetico e misurano le
  variazioni controllate da geni
• I MM possono essere usati per
• misurare diversità genetica
• costituire mappe genetiche
• selezione assistita (MAS)
• supporto allisolamento genico (PC)

Che cosa sono i Marcatori Molecolari ??

• Marcatori Molecolari
• sequenze proteiche e di DNA facilmente
  individuabili e la cui eredità può essere
  controllata
• Polimorfismo in proteine
• proteine del seme
• isoenzimi ed alloenzimi
• Polimorfismi di DNA
• nucleare
• citoplasmatico

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Proprietà desiderabili

• Polimorfico
• Eredità codominante
• Distribuito in tutto il genoma
• Facile e veloce da individuare
• Poco costoso
• Riproducibile / Trasferibile

• Nessun marcatore le possiede tutte

Marcatori proteici

• Breve introduzione alle proteine
• Proteine di conservazione del seme
• Isoenzimi
• Alloenzimi

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Struttura delle proteine
Struttura delle proteine

• Struttura primaria backbone del polipeptide
• Struttura secondaria legami ad idrogeno
  locali
• Struttura terziaria legami che coinvogono i
  gruppi R
• Struttura quaternaria interazione tra
  polipeptidi

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Proteine seed storage
Proteine ed ambiente

• La struttura tridimensionale delle proteine è
  il risultato dellinterazione con lambiente.
• Bisogna quindi tenere conto della denaturazione
  delle proteine .
• . e della diversità della loro funzione
• facilitata dalla complessità di struttura

• Perché usiamo le proteine del seme ??
• i semi sono ricchi di proteine
• le proteine sono disponibili in sufficiente
  quantità
• i semi sono uno stadio dello sviluppo ben
  definito

• La metodologia
• si estraggono le proteine e si separano in
  elettroforesi
• si visualizzano sul gel con la colorazione
  (staining)
• si analizza il pattern delle bande

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Considerazioni ed Applicazioni

• Considerazioni
• co-migrazione
• pattern delle bande complesso
• variazione intraspecifica

• Applicazione della tecnica
• es. frumento, orzo
• recentemente anche melanzana

Isoenzimi ed Alloenzimi

• Forme multiple dello stesso enzima
• isoenzima un enzima, più di un locus genico
• alloenzima un enzima, un locus genico

• Metodologie
• tessuti macerati
• enzimi separati per elettroforesi
• visualizzazione per colorazione istochimica
• analisi del pattern

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Interpretazione del pattern

• Omozigote o eterozigote ??
• Struttura quaternaria dellenzima
• Numero di loci
• Numero di alleli
• Analisi genetiche spesso necessarie

Formazioni di eteromeri
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Applicazioni

• Metodo potente e riproducibile per
• caratterizzare/identificare genotipi
• studi di genetica di popolazione
• esaminare patterns di variazione geografica

• Limitato numero di enzimi disponibili

Marcatori su DNA

• Le basi del DNA
• Metodo RFLP
• Metodi basati sulla PCR
• Marcatori STS
• Marcatori AFLP
• Tecniche elettroforesi

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Le basi del DNA
La sintesi del DNA
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Marcatori RFLP Restriction Fragment Length
Polymorphism

• Gli RFLP esaminano differenze in peso
  mole-colare di specifici frammenti di DNA
  ristretti
• Usualmente si utilizza il DNA totale
• Richiedono DNA puro e di alto peso molecolare

Metodologia RFLP

• Tagliare il DNA in piccoli frammenti
• Separare i frammenti in gel eletttroforesi
• Trasferire i frammenti di DNA su filtro

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Metodologia RFLP

• Visualizzazione dei frammenti di DNA
• sonde radioattive
• sonde non-radioattive
• Analisi dei risultati
• bande selezionate per presenza/assenza
• differenze nel pattern riflettono differenze
  genetiche

• La scelta di sonda ed enzima di restrizione è
  cruciale

Interpretazione dei Risultati
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Esempio di Analisi RFLP su fragola
RFLP vantaggi e svantaggi

• Riproducibili
• Marcatori codominanti
• Tecnica semplice
• Tecnica lunga e costosa
• Utilizzo di sonde radioattive

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Marcatori su DNA

• Le basi del DNA
• Metodo RFLP
• Metodi basati sulla PCR
• Marcatori STS
• Marcatori AFLP
• Tecniche elettroforesi

PCR Polymerase Chain Reaction

• Potente tecnica per amplificare il DNA
• Prevede lutilizzo di cicli di temeperature
• step di denaturazione
• step di annealing
• step di elongazione
• Il DNA amplificato viene separato su gel
  elettroforesi

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I tre passaggi della PCR
PCR componenti reazione

• Utilizzo della Taq polimerasi
• Condizioni di reazione
• Importanza della standardizzazione
• Una reazione contiene
• target DNA
• Taq polimerasi
• uno o più starter o primer
• 4 deoxynucleotidi dATP, dCTP, dGTP, dTTP
• buffer di reazione con il cofattore MgCl2

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PCR riassunto

• DNA polimerasi
• Apparecchio Thermal Cycler
• Profilo delle temperatura (programma)
• Concentrazione del DNA target
• Concentrazione dello ione Mg

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

• Tratti di DNA anonimi amplificati utilizzando
  primer arbitrari
• Metodo veloce per individuare polimorfismi
• Marcatori dominanti
• Problemi di riproducibilità

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Interpretazione dei RAPDs

• I marcatori RAPDs sono anonimi
• I marcatori RAPDs sono dominanti
• Problemi di co-migrazione
• una banda, un frammento ?
• stessa banda, stesso frammento ?

RFLP vantaggi e svantaggi

• Semplici e veloci
• Poco costosi
• Non utilizza radioattivo
• Marcatori dominanti
• Problemi di riproducibilità
• Problemi di interpretazione

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Marcatori su DNA

• Le basi del DNA
• Metodo RFLP
• Metodi basati sulla PCR
• Marcatori STS
• Marcatori AFLP
• Tecniche elettroforesi

STS Sequence-Tagged Sites

• Utilizzano la PCR a partire da
• Sequence-Tagged Microsatellites (STMS)
• Oligonucleotidi ancorati a MS
• inter-simple sequence repeat (ISSR)
• Sequence-characterized amplified regions (SCARs)
• Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)

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Marcatori Microsatelliti

• Sequence-Tagged MS
• In genere single locus multiallelico
• Codominante
• Inter-simple sequence repeats
• Amplificano segmenti adiacenti sequenze ripetute
  (repeats)
• Marcatori dominanti

SCARs and CAPS

• SCARs sequence characterized amplified
  regions
• marcatore single locus derivante da frammento
  RAPD
• CAPS cleaved amplified polymorphic sequence
• Marcatore locus specifico
• Prodotto di amplificazione RAPD utilizzato come
  sonda RFLP

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Marcatori su DNA

• Le basi del DNA
• Metodo RFLP
• Metodi basati sulla PCR
• Marcatori STS
• Marcatori AFLP
• Tecniche elettroforesi

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

• Tecnicamente sfruttano la combinazione tra RFLP
  e PCR
• Il risultato è un fingerprint altamente
  informativo
• Il metodo diviene sempre più popolare

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AFLP La Tecnica
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AFLP vantaggi e svantaggi

• Altamente sensibili
• Altamente riproducibili
• Largamente applicabili
• Costosi
• Tecnicamente difficili
• Necessari radioisotopi
• Problemi di interpretazione

Analisi RAPD su melanzana
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Esempio di Analisi AFLP su vite