I. Support et organisation de l'IG II. M

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I. Support et organisation de l'IGII. Méca. de
conservation de l'IGIII. Mécanismes moléculaires
de l'expression de l'Information génétique

• A. Transcription de l'ADN en ARN
• B. Traduction de l'ARN en protéines
• C. Particularités d'expression des virus

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A. Transcription de l'ADN en ARN
? flux d'information orienté noyau ?
cytoplasme - Localisation synthèse protéique ds
cytoplasme Exp. Pallade 1950 Nécessité et
identification d'un intermédiaire entre ADN et
protéines l'ARNm - Pb intermédiaire vecteur
message - Rappels tous les ARN à la fois dans
noyau et cytoplasme ARN r (80, à 23, 16 et 5S
chez Procaryotes 28, 18, 5.8 et 5 S chez
Eucaryotes) ARN t (15, environ 60
différents) Mais - Trop peu diversifiés /
protéines - Trop stables . - Test de Monod et
Jacob (1960) sur système inductible ? apparition
d'un ARN instable en partie complémentaire de ADN
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A. Transcription de l'ADN en ARN
1- Modalités de la transcription chez les
procaryotes
a) Des ribosomes associés précocement aux ARNm
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(No Transcript)
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b) Influence des propriétés de l'ARN pol sur
l'initiation de la transcription
Rôle des sous-unités - a2 permet association
à b/b' - b liaison à l'ARN catalyse
initiation (rifampycine) élongation
(streptolydine) reconnaissance des
terminateurs - b' liaison à l'ADN (70) et au
facteur s - s reconnaissance promoteurs ?
précision de l'initiation
- structure quaternaire a2, b, b', s - 480
kDa - se fixent sur 5 tours d'hélice (15 nm) -
Demi-vie 60 min.
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Rôle du facteur s - Variabilité - s43 pour
phase végétative - devient s37 qui permet de -
coder pour s29 qui code un nouveau jeu de gènes
pour la phase de sporulation - Reconnaissance
de séquences promotrices (1 sec.) - Ouverture
du Complexe d'initiation rupture liaisons H
sur 10 à 14 nt - Incorporation des 6 à 9
premiers ribonucléotides Ensuite ?
transcription par ARNpol sans facteur s.
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c) Influence des séquences promotrices sur
l'initiation de la transcription
- Cas de l'opéron lactose mise en évidence de
l'interaction ADN / protéines
ARN pol de -60 à 20 Interaction forte de -20 à
20 - Boites ubiquites sur promoteur proximal
TATAAAA en -10 ? zone d'ouverture TTGACA en
-35 ? reconnaissance par ARN pol
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? Eléments inductibles sur certains promoteurs
HSE (Heat Shock element) 14 nt ? Active gènes
codant pour des protéines qui protègent la
cellule contre les réactions dues à la
chaleur (Ex . protéines chaperonnes, protéines de
l'immunité lors de fièvre...) - Position variable
par rapport à TATA - Suffisants pour conférer à
n'importe quel promoteur le caratère de choc
thermique IRE (Interferon regulatory
element) GRE (glucocorticoïdes ) MRE (sensible
à la présence de métaux trace)
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d) Modalités de l'élongation lors de la
transcription
- Nécessité d'un brin matrice - Pas de nécessité
d'amorce - substrats dnTP - Taux d'erreur
10-4 à 10-5 très élevé car pas d'activité
exonucléasique. (idem virus à ARN comme SIDA très
changeant) - Vitesse 40 nt/s chez E.Coli 200
nt/s Phage d'E.Coli - Importance de la topologie
de l'ADN - in-vitro l'ADN super enroulé est
transcrit plus vite que ADN déroulé - in-vivo
mutants de topoisomérase II (gyrase provoque
les super enroulements ) ? transcription
diminuée mutants de topoisomérase I (catalyse la
relaxation des supertours) ? transcription
augmentée.
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(No Transcript)
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e) Terminaison de la transcription
- Séquence de détachement de l'ARNpol
palindrome G/C séquence riche en A/T -
Palindrome permet la réalisation d'une épingle à
cheveux (tige/boucle) qui détache l'enzyme -
Terminateurs dépendants d'un facteur protéique r
interagit avec ARN pol lors d'une pause au
niveau du terminateur - ? antiterminateurs dans
boîtes NUT (20 nt) en amont de terminateur
fixent prot NUS A et N ?modifie l'ARNpol ? ne
reconnaîtra plus le terminateur quand elle
passera dessus.
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f) Contrôle de la transcription cas des opérons
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(No Transcript)
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ARN pol
Represseur
Inducteur
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(No Transcript)
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2- Modalités de la transcription chez les
eucaryotes
Rappel Découplage transcription / traduction dû
à l'enveloppe nucléaire a) Diversité des ARN pol
eucaryotes
ARNpol I - transcripition des gènes codant pour
ARNr45S dans le nucléole (où aura également lieu
la maturation des ARNr et l'association avec
sous-unités ribosomiales) ARNpol II -
transcription des gènes de structure gènes
ARNhn des RNP ARNpol III - transcription des
gènes ARNt et ARNr5S et autres petits ARN
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b) Diversité des séquences promotrices
participant à l'initiation de la transcription
Boites ubiquites sur promoteur proximal TATA
? précise l'initiation au nt n1 site START
et fixe prot TBP (sous unité de TFIID) GC
(CCGCCC) ? cas des gènes "de ménage" (cas des
gène sans boite GC impliqués dans contrôle du
développement embryonnaire) CAAT fixe
CTF Octamère (ATTTGCAT) fixe OTF
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Cas des gènes à plusieurs promoteurs ex. gène
de l'amylase 2 Promoteurs P1 et P2 différents
(tissu spécificité boite TATA). P1 utilisé dans
les glandes salivaires et P2 dans le foie.
Les 2 promoteurs peuvent ici fonctionner en
même temps dans une même cellule
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c) Modalités de l'élongation et de la terminaison
de la transcription
- Elongation idem Procaryotes - Terminaison
mal contrôlée (peu de conséquences)
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d) Contrôle de l'initiation de la transcription
Beaucoup plus fine que chez les Procaryotes ?
Contrôle par état de la chromatine Mee de Gurdon
par transfert de noyau de jeunes embryons de
xénope ? substance cytoplasmique régulée
capable de rendre efficaces tous les gènes Dans
cellules différenciées, une partie de l'info est
non lue (mise sous silence, par méthylation
notamment et reploiement de l'ADN en hélice Z par
exemple) Mee du rôle rétro-inhibiteur des
protéines histones dans la transcription - En
système acellulaire plus il y a d'histones,
moins la transcription se fait - in vivo
méthylations par H3 perturbent reconnaissance par
ARN pol
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(No Transcript)
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? Contrôle par séquences régulatrices en CIS Mee
des URS (upstream regulatory sequences)
transfert de gène (vecteur viral non pathogène)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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? Contrôle par séquences régulatrices en CIS -
Lieu de fixation de dimères protéiques (facteurs
de transcription) - Interaction avec complexe de
préinitiation - Régulation positive ou
négative Cas des Enhancers et Silencers -
Séquences éloignées - Action par reploiement des
l'ADN
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? Intervention des facteurs de transcription -
Propriétés générales des TF domaine de liaison
à l'ADN homéodomaine, agrafe à leucine et doigt
de Zn
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? Modélisation de l'initiation de la
transcription
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? Modélisation de l'intervention des gènes de
commande - 5 des gènes sont dits "de commande" ?
tissu-spécifiques - Séquence homéoboite 180 nt
codant pour homéodomaine (60 aa) ? aa 47, 50, 51
et 54 entrent dans grand sillon d'ADN - Séquence
de l'ADN fixant ces aa très conservée GAAAGCCATTAG
AG - Cas des gènes homéotiques provoquent
homéose (mais pas toujours homéoboite)
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Bonne corrélation spatiale chromosome / individu
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(No Transcript)
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- Cas des gènes de développement Ne provoquent
pas d'homéose Possèdent homéoboite "paired"
octapeptide Ex. gènes Pax
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Gènes Période et lieu d'expression chez l'embryon Expression chez l'adulte
Pax-1 j10-17 Mésoderme somitique sclérotome Non
Pax-2 j10-18 Rein en développement. Tube nerveux, rhombencéphale, vésicule otique, vésicule optique   Non
Pax-3 j8.5-16 Certaines régions du cerveau, partie dorsale du tube nerveux, cellules de la crête neurale, dermomyotome Non
Pax-4 Non déterminé Non déterminé
Pax-5 j10-14 Mésencéphale, tube nerveux, foie foetal Rate, ganglions lymphatiques, sang
Pax-6 j8-18 Cerveau antérieur et postérieur, hypophyse, épithélium olfactif, oeil, tube nerveux (zone ventrale) Non
Pax-7 j8-17 Groupe de cellules dans tout le cerveau, puis limité au mésencéphale, tube neural (zone dorsale) Non
Pax-8 À partir de j11.5 Expression transitoire dans tout le tube nerveux et le myélencéphale(j11.5 à j12.5). Thyroïde et rein en développement Thyroïde, rein
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Mécanisme d'action des gènes de développemnt Cas
des gènes Pax Pax-6 gène "maître" ? régule
ensemble de gènes "secondaires" régulant
expression d'autres gènes-cibles ? cascade de
2000 à 3000 gènes ? mise en place d'une structure
comme l'œil
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III. Méca. de l'expression de l'IG

• A. Transcription de l'ADN en ARN
• B. Traduction des ARNm en protéines
• C. Particularités d'expression des virus

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Observation des ribosomes sur ARNm - Expérience
de Gros marquage préalable des ribosomes 35S (
Mg2 élevée évite déstabilisation) marquage
court des ARNm au 14C ou U tritiée. - Chez
Procaryotes traduction immédiate, couplée à
transcription dans le cytoplasme - Chez
Eucaryotes REG poly(ribo)somes
cytoplasmiques (un ribosome tous les 80 nt soit
10 à 20 ribosomes pour une protéine moyenne de
400 aa).
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1- Modalités de la traduction chez les procaryotes
Rappel synthèse en batterie ARN
polycistronique amplification du message a)
Prise en charge des aa par les ARNt
L'aminoacyl-ARNt-transférase (dimère ou
tétramère) - spécifique d'un aa (? ? 20
aminoacyltransférase) - ? ARNt isoaccepteur
(flottement du code) - hydrolyse ATP en AMP ?
intermédiaire acide aminé-adényl monophosphate
2 Pi ? liaison ester covalent en 3'OH de la queue
ACC de l'ARNt détachement de AMP
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(No Transcript)
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b) Initiation de la traduction
Les acteurs de l'initiation - ARNm -
ribosome - NformylméthionineARNt (ARNt
initiateur) - facteurs d'initiation IF3
(reconnaissance petite ss-u sur séquence Shine
Dalgarno inhibition par streptomycine), IF2
(fixation du 1er ARNt), IF1 (fixation de grande
ss-u)
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Architecture des séquences de l'initiation
Rappel pas de coiffe sur les ARNm des
Procaryotes - 15 nt de long environ -
complémentaire de séquence Shine Dalgarno (ARNr
16S de petite sous-unité 30S du ribosome) - riche
en purine dont séquence conservée AGGAGG - en
amont (coté 5') du codon START (AUG) ? assure
positionnement précis à 1 nt près
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Fixation du 1er amino acyl ARNt sur petite
sous-unité - Rappel Nformyl méthionine ARNt -
Fixation sur site P ("peptidyl") - Intervention
de IF2 qui hydrolyse GTP
Fixation à la grande sous-unité - Intervention
de IF1 - Fixation du second aa-ARNt au site A -
Site catalytique ribozyme de grande sous-unité
forme lien peptidique (sans consommation
d'énergie utilise haut niveau énergétique des
aminoacyls-ARNt) - Largage des IF consomme un
GTP
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c) Elongation lors de la transcription
- Sens 5' ? 3' de l'ARNm - Intervention de 2
sites distincts sur la grande sous-u ribosomiale
- Site A (aminé) - Site P (peptide) - Site E
(exit) très mal connu
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Polypeptide en cours de synthèse
Sens de déplacement du ribosome
43
peptidyl-ARNt
ARNt sortant
aa-ARNt
hélice de l'ARN16S
petite sous unité
grande sous unité
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INITIATION
ELONGATION
Synthèse du lien peptidique Trans-location
Positionnement d'un nouvel aa-ARNt
Charge de l'ARNt
GTP?GDPPi
GDP
GTP
TERMINAISON
Facteurs de terminaison GTP
GTP?GDP
GTP?GDP
PolypeptideARNt
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- Site A (aminé) Arrivée de l'aminoacyl ARNt
interagissant avec facteurs d'élongation GTP
pour l'appariement codon/anticocon - Site P
(peptide) synthèse de la liaison peptidique par
action d'une petidyl transférase de la grosse
sous-unité (inhibée par chloramphénicol) (sans
consommation d'énergie) - Translocation -
Intervention d'un facteur translocase - consomme
1 GTP - Progression de 3 nt - Vitesse
d'élongation 20 aa/sec (pas très rapide mais
plusieurs ribosomes en même temps)
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d) Terminaison de la traduction
- Arrivée du codon STOP sur le site A - permet
mise en place d'un facteur de dissociation qui
permet l'hydrolyse de la liaison COOH- ARNt 1
GTP - ce qui libère le polypeptide nouvellement
synthétisé. - Coupure du Nformyl méthionine
initial et séparation des 2 sous unités
ribosomiales 1 GTP
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BILAN Coût de la polymérisation d'1 aa - 1
ATP pour activation de aa (rupture de 2
liaisons) - 1 GTP pour positionnement sur site A
en présence de IF2 (plus 1 GTP pour premier
positionnement de Nformyl méthionine ARNt sur
site P) - 1 GTP pour Translocation - TOTAL 4
liaisons Phosphoester pour une liaison peptidique
Initiation 1 GTP Terminaison 1 GTP
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2- Différences de modalités de la traduction chez
les eucaryotes
a) Initiation
- ARNt initiateur Méthionine (et non
Nformylmeth comme chez bactéries) -
Methionine-ARNt chargée sur petite sous unité
ribosomale avant fixation de l'ARNm eIF2 -
Autres facteurs d'initiation très nombreux et
différents des procaryotes mais participent aux
mêmes étapes. Contrôle précis du taux de synthèse
en relation avec cycle cellulaire et nutriments
disponibles dans le milieu (? Procaryotes) -
Fixation de l'ARNm en 5' puis recherche ("en
ligne") du premier codon start AUG (contrôlé par
séquence Kozak) (GCC) A/G CC ATG G - libération
des IF puis - fixation de grande sous unité
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b) Elongation
- Elagage rapide de méthionine par
amionopeptidase spécifique - Pas d'ARNm
polycistroniques premier codon AUG START. les
autres codons AUG ne peuvent plus servir - Deux
destinées des Protéines - cytosolique par
ribosomes libres - protéines intramembranaires
ou excrétées guidées dans REG par séquence
signal 16 nt.
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3- Contrôle de la traduction
a) Contrôle par les ribosomes
Contrôle de la population des ribosomes Ex chez
E. coli prot L35 et L20 (fixent ARN 23S) de
grande sous unité ribosomiale codées sur un même
opéron ? grand ARN pré r possède longue séquence
en 5' reployé en tiges/boucles mimant S3D de
l'ARN23S ? inhibition compétitive de L20 par son
propre ARNm!
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a) Contrôle par les ribosomes
Inhibition de la fixation des ribosomes sur
l'ARNm par l'aminoacyl synthétase Ex. E. coli
AminoacylARNt synthétase spécifique de
Thréonine. compétition avec domaine en 5' de
l'ARNm (qui forme deux tige/boucles qui miment
chacun la boucle Tpsi de l'ARNt Threonine) ?
L'aminoacylARNt synthétase inhibe fixation du
ribosome (mee de l'importance du domaine N tal
délétion en N tal ? se fixe toujours sur ARNm
mais plus de gène pour la fixation du ribosome!)
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b) Autres contrôles
Contrôle par dé/phosphorylation des TF
Adressage des protéines - Séquence signal 16aa
reconnue par SRP - reconnait SRP Receptor du
REG - ancrage passage par Protéines de
translocation
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Maturation des protéines - Glycosylations
Dolichol transmembranaire transfert
oligosaccharides (NAcLgu / Man/ Glu) vers
séquence consensus Asn X- Ser (ou Thr) face
luminale du REG
? 10 enzymes du REG/ golgi CIS / golgi TRANS
modifient oligosaccharides
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Exemple de l'insuline Préproinsuline 100 aa avec
peptide signal (intron n1)Vésicules de
sécrétion des cellules B des ilôts de
Langherans(coupure du peptide signal dans golgi)
(16 aa)proinsuline84 aaCoupure du peptide
C(possède également intron n2)Insuline
active, maturation du peptide C(33 aa) Les
chaînes A (21 aa) et B (30 aa) sont reliées par
des ponts disulfures dans l'insuline mature.Le
rôle métabolique du peptide C n'est pas encore
clair, mais il est sécrété (vésicules
clathrine) en quantité équimolaire à l'insuline.
Utilisé pour quantifier la production d'insuline.