BTS Analyses de Biologie M

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BTS Analyses de Biologie MédicaleCours de
Microbiologie (1e année)

• Chapitre n6 Les agents antimicrobiens
• microbia_at_free.fr

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1. Définitions et généralités
StérilisationDésinfectantsAntiseptiquesAntibiot
iquesSpectre dactivitéBactériostase /
BactéricidieCMI / CMB
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Croissance bactérienne en présence dantibiotique
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Découverte des antibiotiques par Fleming

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Les micro-organismes producteurs dantibiotiques
PROCARYOTES Bactéries Streptomyces
(Actinomycètes) Streptomycine Erythromycine
Kanamycine Néomycine Nystatine
Bacillus Bacitracine Polymixines EUCARY
OTES Moississures Penicillium Pénicilline
Griséofulvine

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Les rapports entre malade, agent infectieux et
antibiotique
7
2. Classification des antibiotiques
8
Mode daction des antibiotiques la notion de
cible

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2.1. Les b-lactamines

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Structure des b-lactamines

• Les béta-lactamines sont caractérisées par un
  cycle béta-lactame associé à un noyau
  thiazolidine formant lacide 6-amino-pénicilliniqu
  e (pénicillines) ou à un noyau dihydrothiazine
  formant lacide 7-amino-céphalosporanique
  (céphalosporines). Ces antibiotiques, actifs
  lorsque les bactéries sont en phase de croissance
  exponentielle, inhibent la synthèse de
  peptidoglycane, et plus particulièrement la
  réaction de transpeptidation. Les béta-lactamines
  se fixent sur des protéines liant la pénicilline
  (PLP ou PBP)  ce sont principalement des enzymes
  (carboxypeptidases) qui interviennent dans
  lassemblage du peptidoglycane. Les
  béta-lactamines activent également les
  autolysines bactériennes.

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Mode daction des b-lactamines
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Mode daction
2.2. Les glycopeptides
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2.3. Les aminosides 2.4. Les macrolides et
apparentés
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Mode daction des aminosides et des macrolides
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Mode daction du chloramphénicol (CP) et des
tétracyclines
2.5. Les phénicolés 2.6. Les tétracyclines
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Mode daction des sulfamides et du triméthoprime
2.7. Sulfamides et du triméthoprime
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Mode daction
2.8. Quinolones
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2.9. Autres antibiotiques
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3. Lantibiogramme
Lantibiogramme a pour but de déterminer in vitro
lantibiotique le plus actif sur le germe, cest
à dire celui qui sera prescrit au malade infecté
par ce germe. Un certain nombre de facteurs
susceptibles de modifier lactivité
antimicrobienne de lagent testé doivent être
pris en compte  - Lantibiotique  il doit
conserver son activité au cours du test (à 37C)
et sa capacité de diffusion en milieu gélosé
solide doit être convenable. - Le milieu  sa
composition doit être rigoureusement définie pour
que les résultats soient reproductibles. - Les
bactéries  le nombre de bactéries mises au
contact de lantibiotique devrait toujours être
le même. Lactivité métabolique de la bactérie et
la durée dincubation sont des facteurs
importants aussi. La mesure de lactivité
antimicrobienne seffectue toujours avec des
souches pures. Mueller-Hinton (Gélose) Usage
Gélose riche pour la réalisation de
l'antibiogramme standard Composition infusion
de viande de bœuf 300,0 ml peptone de caséine
17,5 g amidon de maïs 1,5 g agar 17,0 g pH
7,4 Préparation 38 g par litre. Stérilisation
à l'autoclave. Lecture Cette gélose
standardisée est la gélose permettant de tester
l'action des antibiotiques sur les bactéries.
Elle peut être additionnée de sang (pour les
Streptococcus ), d'extrait globulaire (pour
Haemophilus ), Elle doit être coulée en boîte de
façon à obtenir une épaisseur de 4 mm. Il existe
un bouillon équivalent.
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Courbe de concordance
Les méthodes par diffusion en milieu gélosé
solide permettent dobserver des zones
dinhibition autour des sources dantibiotiques.
Il existe une relation linéaire entre le diamètre
de la zone dinhibition et le logarithme de la
concentration au niveau de la source. En effet,
lantibiotique diffuse dans le milieu selon un
gradient de concentration inversement
proportionnel à la distance du dépôt du disque
imprégné dantibiotique. Pour établir la relation
entre le diamètre de la zone dinhibition et la
CMI, on utilise des courbes de concordance
établies par des laboratoires spécialisés
(Institut Pasteur) avec des souches de référence.
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Interprétation
Un germe est dit sensible si la CMI de
lantibiotique pour le germe est plus faible que
la concentration critique inférieure (taux
sanguin moyen obtenu aux posologies habituelles
et sans danger pour lorganisme). Un germe est
dit de sensibilité intermédiaire si la CMI de
lantibiotique pour le germe est à lintérieur de
la zone des taux thérapeutiques, cest à dire
entre la concentration critique inférieure et la
concentration critique supérieure (taux sanguin
maximal obtenu par ladministration de fortes
doses). Un germe est dit résistant si la CMI de
lantibiotique pour le germe est plus élevée que
la concentration critique supérieure. Il faut
distinguer cette résistance clinique de la
résistance absolue dun microorganisme vis-à-vis
dun antibiotique donné.
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E-Test
Il s'agit d'une technique de détermination de la
CMI fondée sur l'utilisation de bandelettes
imprégnées d'un gradient exponentiel prédéfini de
l'antibiotique à tester. LE-test associe les
caractéristiques des méthodes de diffusion et de
dilution en milieu solide. Les bandelettes sont
des supports inertes, hydrophobes. Elles sont
appliquées sur la surface d'une gélose
préalablement ensemencée avec la souche à
étudier. Après incubation, l'inhibition de la
croissance bactérienne se traduit par la présence
d'une ellipse dont les points d'intersection avec
la bandelette définissent la CMI. Une échelle de
lecture imprimée sur la face supérieure de la
bandelette permet une interprétation
rapide. Résultat dun  E-test  pour la
pénicilline G (concentrations exprimées en
µg.mL-1)
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Antibiogramme miniaturisé en milieu liquide (ATB
Gram-)

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4. Association dantibiotiques
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Association dantibiotiques schématriangulaire
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5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques
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5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques
Pour qu'un antibiotique soit actif, il faut Pour résister à lantibiotique, la bactérie peut
- qu'il pénètre dans la bactérie - devenir imperméable ou s'opposer à son transport - lexcréter activement
- qu'il ne soit ni modifié ni détruit - synthétiser des enzymes qui le modifient - synthétiser des enzymes qui l'hydrolysent - synthétiser des protéines qui le séquestrent
- qu'il se fixe à sa cible - modifier le site de reconnaissance de la cible - produire la cible de façon plus importante
- quil bloque une voie métabolique - changer de voie métabolique
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5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques

• L'imperméabilisation
• Elle concerne la membrane externe (pour les
  bactéries à Gram négatif) ou la membrane
  cytoplasmique (pour toutes les bactéries). C'est
  le mécanisme le plus souvent responsable de la
  résistance naturelle . Il peut concerner tous les
  antibiotiques.
• Modification de la cible
• C'est un mécanisme dont lorigine génétique est
  souvent mutationnelle. La cible est légèrement
  modifiée par la substitution d'un acide aminé
  dans la protéine (s'il s'agit d'une enzyme ou
  d'une protéine ribosomale) ou la substitution
  d'un nucléotide (s'il s'agit de l'ARN ribosomal).
  Il peut concerner les b-lactamines, les
  aminosides, les macrolides, les quinolones
• On peut rencontrer ce mécanisme dans la
  résistance plasmidique dans le cas des
  macrolides, une méthylase modifie deux
  nucléotides du ribosome qui perd son affinité
  pour l'antibiotique. Dans le cas des sulfamides
  ou du triméthoprime, le plasmide code pour des
  isoenzymes qui ne fixent pas ces molécules.

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5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques

• L'inactivation ou la modification de
  lantibiotique
• C'est un mécanisme dont lorigine génétique est
  souvent plasmidique. Il concerne
  particulièrement 
• - les béta-lactamines  béta-lactamases
  (pénicillinases, céphalosporinases) hydrolysant
  la molécule,
• - les aminosides  transférases qui phosphorylent
  ou acétylent certains sites de la molécule,
• - les phénicolés  transférase qui acétyle la
  molécule.
• On peut rencontrer ce mécanisme dans la
  résistance mutationnelle certaines bactéries
  synthétisent des faibles quantités de
  béta-lactamases (la résistance est alors dite de
  bas niveau). Une mutation altère le gène de
  régulation et provoque une synthèse accrue de
  lenzyme qui est dite déréprimée (la résistance
  est alors dite de haut niveau).

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6. Déterminisme génétique des résistances aux
antibiotiques

• Résistance naturelle (chromosomique) caractère
  despèce
• La résistance naturelle est caractéristique dune
  espèce bactérienne. Elle délimite le spectre
  naturel de l'antibiotique et constitue une aide à
  lidentification.
• La résistance naturelle se traduit habituellement
  par des CMI supérieures à la valeur critique
  basse de concentration (c) de lantibiotique
  concerné.
• Les protéines codées par le chromosome ont une
  structure telle qu'elles empêchent la pénétration
  de l'antibiotique (les membranes sont
  imperméables, un système de transport est absent)
  ou l'inactivent (les béta-lactamases
  chromosomiques).

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6. Déterminisme génétique des résistances aux
antibiotiques
Résistances naturelles
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6. Déterminisme génétique des résistances aux
antibiotiques

• Résistances acquises seules certaines souches
  dune espèce sont concernées
• Les résistances acquises, sont consécutives à des
  modifications de l'équipement génétique
  chromosomique ou plasmidique, qui ne concernent
  que quelques souches d'une même espèce mais
  peuvent s'étendre  leur fréquence varie dans le
  temps mais aussi dans l'espace (région, ville,
  hôpital).
• Résistance mutationnelle (chromosomique)
• Une altération de lADN chromosomique entraîne la
  synthèse de protéines modifiées les membranes
  deviennent imperméables, un système de transport
  n'accepte plus l'antibiotique, la cible (enzyme
  ou ribosome) ne fixe plus l'antibiotique, un
  répresseur ne contrôle plus certains gènes
  (dérépression des béta-lactamases).
• Les résistances mutationnelles sont
• - spontanées elles préexistent à l'utilisation
  de l'antibiotique,
• - stables elles se transmettent verticalement
  dans le clone bactérien,
• - spécifiques elles ne concernent qu'un
  antibiotique ou une famille d'antibiotiques à la
  fois,
• rares le taux de mutation se situe
  habituellement entre 10-7 et 10-8.

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6. Déterminisme génétique des résistances aux
antibiotiques

• Résistance extra-chromosomique (plasmidique ou
  liée à un transposon)
• L'acquisition d'une information génétique
  supplémentaire permet la synthèse de protéines
  additionnelles dont la présence modifie les
  membranes ou dont l'activité enzymatique se
  révèle capable de modifier la cible ou
  d'inactiver l'antibiotique.
• Les résistances extra-chromosomiques ont pour
  support génétique un plasmide (ou un transposon)
  acquis par conjugaison ou plus rarement par
  transduction ou transformation
• Les résistances plasmidiques
• - sont fréquentes (plus de 80 des résistances
  acquises),
• - sont contagieuses et se transmettent
  horizontalement entre bactéries cohabitant dans
  un même environnement, même entre espèces
  différentes,
• peuvent concerner plusieurs antibiotiques, voire
  plusieurs familles d'antibiotiques, entraînant
  une multirésistance.
• L'usage d'un seul antibiotique dont la résistance
  est codée par un gène plasmidique sélectionne les
  souches résistantes à toutes les molécules dont
  le gène de résistance se trouve sur le plasmide,
  ce qui entraîne la sélection rapide de souches
  multirésistantes. Ce sont ses souches
  bactériennes résistantes à plusieurs familles
  d'antibiotiques pour lesquelles les possibilités
  thérapeutiques sont réduites et parfois
  anéanties. On constate, en milieu hospitalier
  surtout, une recrudescence de la fréquence
  d'isolement de ces souches qui doivent être
  détectées rapidement et signalées car elles
  imposent aux services d'hospitalisation des
  mesures strictes pour éviter leur diffusion.
• Certaines espèces bactériennes sont plus
  particulièrement concernées par cette
  multirésistance 
• Staphylocoques méticillino-résistants (SARM)
• Souches de Pseudomonas productrices de
  céphalosporinase déréprimée
• Entérobactéries productrices de b-lactamase à
  spectre étendu ( BLSE )
• Acinetobacter (dont lespèce A. baumannii)
  naturellement résistants à de nombreux
  antibiotiques

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7. Mise en évidence des résistances acquises au
laboratoire
Mise en évidence des béta-lactamases Les
béta-lactamases hydrolysent le cycle b-lactame
des pénicillines (pénicillinases) et des
céphalosporines (céphalosporinases) avec plus ou
moins de spécificité, les rendant ainsi
inactives. Les béta-lactamases peuvent être  -
constitutives (Haemophilus influenzae,
Neisseria) ou inductibles (Staphylococcus
aureus)  - dorigine chromosomique ou
plasmidique. Il existe une méthode simple de
mise en évidence rapide de ces enzymes la
méthode à la céphalosporine chromogène. Le test
Céfinase de BioMérieux est réalisé grâce à un
disque imprégné dun substrat chromogène (la
nitrocéfine) sur lequel on dépose une colonie
bactérienne  en présence de béta-lactamase, il
se forme un produit coloré rouge.
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7. Mise en évidence des résistances acquises au
laboratoire
Mise en évidence des béta-lactamases à spectre
étendu (BLSE) Les béta-lactamases à spectre
étendu confèrent une résistance de haut niveau à
quasiment toutes les béta-lactamines, à
lexception des céphalosporines de 3e génération
(résistance de bas niveau). Les BLSE sont
déterminées génétiquement par des plasmides (et
sont donc transmissibles entre bactéries). Elles
sont inactivées par les inhibiteurs de
béta-lactamase tels que lacide clavulanique.
Leur mise en évidence repose sur la présence
dune synergie entre une céphalosporine de 3e
génération (Céfotaxime ou Ceftazidime par
exemple) et un inhibiteur de b-lactamase (on
utilise souvent le disque AMC contenant de
lamoxicilline et de lacide clavulanique).
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7. Mise en évidence des résistances acquises au
laboratoire
Mise en évidence des béta-lactamases à spectre
étendu (BLSE)
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7. Mise en évidence des résistances acquises au
laboratoire
Résistance des staphylocoques aux
béta-lactamines Il sagit dune résistance à la
méticilline due à une modification des PLP
(souches dites  méticillino-résistantes  ou
 SARM   Staphylococcus aureus résistant à la
méticilline). Lacquisition dun gène
chromosomique mecA entraîne une production de
PLP2a (dont laffinité vis-à-vis des
béta-lactamines est faible). La mise en évidence
de cette résistance est délicate, car seulement
une partie de la population bactérienne (1
bactérie sur 10 000 à 100 000) exprime cette
résistance (doù le nom de résistance
hétérogène). Les conditions de culture doivent
être modifiées (incubation à 30C ou
ensemencement en milieu Mueller-Hinton hypersalé)
pour observer des colonies dans la zone
dinhibition autour dun disque doxacilline.
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7. Mise en évidence des résistances acquises au
laboratoire
Résistance des staphylocoques aux béta-lactamines
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7. Mise en évidence des résistances acquises au
laboratoire
Il sagit dun test général mettant en évidence
toute réaction dinactivation dun antibiotique.
Une souche sensible à lantibiotique testé est
ensemencée sur un milieu Mueller-Hinton. Un
disque imprégné de lantibiotique testé est placé
au centre de la boîte. Des stries sont réalisées
autour du disque avec les souches à tester et des
souches témoin. Après incubation, la présence de
culture de la souche sensible au contact des
souches test ou témoin dans la zone dinhibition
témoigne de linactivation de lantibiotique.
40
Bibliographie Microbiologie technique, 1.
Dictionnaire des techniques, Jean-Noël JOFFIN,
Guy LEYRAL, CRDP Bordeaux, 2001.Le paradoxe des
antibiotiques, Stuart B. LEVY, Editions Belin,
1999.Pour la science - n232 (février 1997) 
 La résistance des bactéries aux
antibiotiques .- n331 (mai 2005)   Les
infections à lhôpital    Consommation
dantibiotiques et résistance des bactéries .La
recherche - n384 (mars 2005)   Le grand
désert des antibiotiques . Sites
internet Les ressources en ligne sont
extrêmement nombreuses sur le sujet (tapez
 antibiotiques  ou  antibiogramme  sur Google
par exemple), mais il faut sélectionner les sites
les plus rigoureux. Quelques suggestions http//
www.123bio.net/cours/http//www.frm.org/ (tapez
 antibiotiques  dans le champ de recherche en
haut à droite).http//www.microbes-edu.org/etudia
nt/etudiants.htmlhttp//www.bacterio.cict.fr/bacd
ico/atbq/sensibilite.htmlhttp//anne.decoster.fre
e.fr/http//pedagogie.ac-montpellier.fr/Disciplin
es/sti/biotechn/microbio.htmlhttp//biomserv.univ
-lyon1.fr/wiki/dpbcoursd1/moin.cgi/Antibio Fichi
ers  pdf  à télécharger (cours de lUniversité
de Genève) http//www.unige.ch/sciences/biologie
/public/pif/polycop.htm