Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica

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Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale
Amiotrofica
Internato di tesi svolto presso il Dipartimento
di Scienze Neurologiche, Università degli Studi
di Milano Fondazione IRCCS CA GRANDA Ospedale
Maggiore Policlinico
Tesi di Laurea di Serena Diana Ghezzi
Relatore Chiar.ma Prof.ssa Silvia DE BIASI
Correlatore Chiar.mo Prof. Giacomo P. COMI
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Sclerosi Laterale Amiotrofica
La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una
patologia neurodegenerativa fatale, risultato del
preminente interessamento dei motoneuroni
superiori e inferiori. La durata di malattia dal
momento dellesordio dei sintomi è in media di
3-5 anni con un decorso più rapido nelle forme ad
esordio bulbare.
tipo di SLA tipo di SLA gene classe classe
geni mendeliani geni mendeliani geni mendeliani geni mendeliani geni mendeliani
SLA1 SOD1 SOD1 enzima detossificante enzima detossificante
SLA2 ALS2 ALS2 signali GEF signali GEF
SLA4 SETX SETX metabolismo del DNA e dell RNA metabolismo del DNA e dell RNA
SLA5 SPG11 SPG11 recettore o trasportatore di membrana recettore o trasportatore di membrana
SLA6 FUS FUS legame al RNA, silenziamento e riparo del DNA legame al RNA, silenziamento e riparo del DNA
SLA8 VAPB VAPB traffico vesciculare traffico vesciculare
SLA9 ANG ANG neovascolarizzazione neovascolarizzazione
SLA10 TARDBP TARDBP legame allRNA ed exon skipping legame allRNA ed exon skipping
SLA DCTN1 DCTN1 trasporto assonale trasporto assonale
SLA-FTDP MAPT MAPT assemblamento dei microtubuli e loro stabilità assemblamento dei microtubuli e loro stabilità
loci mendeliani loci mendeliani loci mendeliani loci mendeliani loci mendeliani
SLA3 SLA3 Ignoto Ignoto Ignota
SLA7 SLA7 Ignoto Ignoto Ignota
SLA-X SLA-X Ignoto Ignoto Ignota
SLA-FTD1 SLA-FTD1 Ignoto Ignoto Ignota
SLA-FTD2 SLA-FTD2 Ignoto Ignoto Ignota
Lexitus avviene generalmente in seguito a
paralisi della muscolatura respiratoria
La diagnosi è essenzialmente clinica, non esiste
infatti un test diagnostico specifico.
5-10 familiari (SLAf) 90-95 sporadici (SLAs)
Dati familiari ed epidemiologici indicano che i
fattori genetici contribuiscono alla sua
patogenesi.

• INTRODUZIONE

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TARDBP
La proteina TAR DNA binding protein (TDP43) è il
principale componente delle inclusioni
citoplasmatiche neuronali ubiquitino-positive
presenti nella maggior parte dei casi SLAs e di
SLAf negativi per mutazioni di SOD1
Nel tessuto nervoso dei pazienti SLA, TDP43 è
iperfosforilata, ubiquitinata e clivata in modo
anomalo. Si ipotizza che in condizioni
patologiche la proteina sia eliminata dal nucleo
e si accumuli a livello del citoplasma innescando
la degenerazione motoneuronale

• INTRODUZIONE

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TARDBP (TDP43)
1p36

1. regolazione della trascrizione
2. regolazione dello splicing
3. stabilità dellmRNA

• INTRODUZIONE

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OBIETTIVI
Lo scopo del nostro studio è stato quello di
caratterizzare geneticamente lampia coorte di
pazienti SLA afferenti allAmbulatorio Malattie
del Motoneurone Dipartimento di Scienze
Neurologiche Policlinico di Milano.
Tale studio ci ha permesso di individuare la
mutazione A382T risultata essere la variante più
comune sul territorio nazionale. Abbiamo quindi
costruito un modello cellulare che permettesse di
studiare in vitro gli effetti di tale mutazione.

• SCOPO

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SCREENING GENETICO
Pazienti SLA Soggetti SANI
numero di soggetti 213 181
casi familiari 26
genere (M/F) 122/91 102/79
età di insorgenza (anni) 58.3 12.8
età al prelievo (anni) 60.8 12.5 67.4 8.8
insorgenza bulbare 21.4
durata della malattia (mesi) 31.6 29.4
SOD1, VAPB e ANG positivi nessuno
4 mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3
sporadici)
La frequenza mutazionale è risultata pertanto
essere del 2.3 calcolata sullintera coorte di
pazienti (1.6 nelle forme sporadiche e 7.7 in
quelle familiari).

• RISULTATI

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SCREENING GENETICO

• RISULTATI

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SCREENING GENETICO

• RISULTATI

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Costruzione del modello cellulare
A
B
NdeI
A
B
cDNA

• RISULTATI

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Validazione del modello cellulare

• RISULTATI

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Validazione del modello cellulare
GAPDH
TDP43
RISULTATI
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Costruzione del modello con GFP
TDP43WTGFP
TDP43A382TGFP
RISULTATI
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CONCLUSIONI
GENETICA
Il quadro clinico della SLA10 è analogo a quello
della malattia classica, con qualche variabilità
interfamiliare per quanto riguarda età e sito di
esordio
Paziente genere paese dorigine ereditarietà TDP43 insorgenza insorgenza durata (mesi)
Paziente genere paese dorigine ereditarietà TDP43 età sede durata (mesi)
A, V3 M Belgio AD G348C 50 spinale 36 a
A, V1 M Belgio AD G348C 53 spinale -
A, III3 F Belgio AD b 67 spinale 36-48
A, III4 M Belgio AD b 39 spinale 36
A, III5 M Belgio AD b 36 spinale - a
A, III6 F Belgio AD b 54 spinale 36
A, IV1 M Belgio AD b 66 spinale 48
A, IV3 M Belgio AD b 58 spinale 48
A, IV6 F Belgio AD b 53 spinale 60
B, III2 M Italia AD A382T 50 spinale con crampi agli arti inferiori 60 a
B, II5 M Italia AD b 50 spinale con debolezza allarto superiore sinistro 36
C M Italia sporadica A382T 54 spinale con paresi alla mano sinistra -
D F Italia sporadica G294V 73 spinale con debolezza progressiva agli arti inferiori 36
E M Italia sporadica G295S 64 spinale con debolezza e atrofia agli arti superiori 36a
La frequenza mutazionale del gene TARDPB nella
nostra coorte di paziente è risultata pari
al 1.6 nei casi sporadici (sovrapponibile a
quanto riportato in letteratura) 7.7 nei casi
familiari (maggiore di quanto descritto, circa il
5).
E interessante notare come, per quanto riguarda
le forme di SLA a trasmissione autosomica
dominante, la rilevanza mutazionale di TARDBP sia
paragonabile, se non superiore, a quella di SOD1,
nel nostro come in altri studi.

• DISCUSSIONE

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CONCLUSIONI
ANALISI FUNZIONALE
Per poter studiare gli effetti in vitro della
mutazione A382T abbiamo costruito due modelli
cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma
wild-type che quella mutata.
DISCUSSIONE
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CONCLUSIONI
ANALISI FUNZIONALE
Per poter studiare gli effetti in vitro della
mutazione A382T abbiamo costruito due modelli
cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma
wild-type che quella mutata.
mRNA non tradotto
proteina degradata
DISCUSSIONE
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PROSPETTIVE

1. Proseguire la caratterizzazione genetica
2. Approfondire lo studio dei meccanismi di
   degradazione proteica
3. Verificare leventuale regolazione dei livelli di
   trascritto
4. Confermare i dati fin qui ottenuti anche con i
   modelli esprimenti la proteina legata alla GFP
5. Replicare gli esperimenti validati nelle HEK
   anche in un modello neuronale (es. SK-N-SH)
6. Valutare i meccanismi di neurogenesi nei modelli
   cellulari fin qui descritti

DISCUSSIONE
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RINGRAZIAMENTI