Diapositiva 1

1
ESTUDI ESTRUCTURAL I EVOLUTIU DEL SISTEMA
ACTINA-MIOSINA
DE ACHA, MARIA BUSQUETS, ARNAU DOMINGO, ALEXANDRA
2
INDEX

• - Introducció
• - Material i mètodes
• - Actina
• - Miosina
• - Complex Actina-Miosina
• - Conclusions

3
INTRODUCCIÓ

• Els músculs són peces imprescindibles per tal que
  el cos tingui moviment

ACTINA MIOSINA
Gran quantitat de molècules i mecanismes
reguladors implicats
4
MATERIAL I MÈTODES

• ESTUDI ESTRUCTURAL
• Obtenció destructures al PDB i SCOP.
• Rasmol
• Stamp (superposició estructures)
• Recerca bibliogràfica Pubmed i Google

• ESTUDI EVOLUTIU
• Obtenció de seqüències Swissprot i Pfam.
• Psi blast (búsqueda de seqüències i estructures
  homòlogues)
• Clustalw (alineaments)
• Bioedit (anàlisi alineaments)

5
ACTINA
6
ACTINA

• Present en tots els eucariotes
• Proteïna del citoesquelet
• Constitueix el 5 del total de proteïnes
  cellulars ? Múscul fins a un 20
• Monòmers dactina (actina-G)
• Filaments dactina (actina-F)

POLIMERITZEN
7
Filament dactina

• Monòmers dactina es polimeritzen gràcies
• ATP
• Cations monovalents i divalents
• Filament dactina
• - Hèlix de monòmers dactina
• - Estructura polaritzada
• Extrem o en punta ? creixement lent
• Extrem o ampli ? creixement ràpid

-

8
Filament dactina
-
ADP
PDB 1ALM PDB 1J6Z PDB 1NWK
ATP

9
Monòmer dactina

• Classificació SCOP

• CLASSE Alfa / Beta
• FOLD/PLEGAMENT Motiu Ribonucleasa H-like
• SUPERFAMÍLIA Domini Actin-like ATPasa
• FAMÍLIA Actina/HSP70

10
Monòmer dactina
Subdomini 4
Subdomini 2
Subdomini 1
PDB 1J6Z Resolució 1,54 Å
Subdomini 3
11
Plegament de lactina
3capes a/ß/a
12
Plegament de lactina
3capes a/ß/a
13
Plegament de lactina
Làmina ß intermitja ? 5 cadenes (dordre 3 2 1 4
5) Cadena 2 antiparallela
14
Actina-ADP vs Actina-ATP
Actina-ADP
5º
10º
Actina-ATP
ADP
ATP
Sc 7,76 RMS 1,66 Å
15
Actina-ADP
ADP
Ca2
PDB 1J6Z Resolució 1,54 Å
16
Actina-ADP centre dunió
His 73 metilada
Arg 183
Asp157
Ser 14
ADP
Lys18
17
Actina-ADP centre dunió
18
Actina-ADP centre dunió
Arg 183
Asp157
Pß
ADP
Pa
19
Actina-ADP hèlix a subdomini 2
Val 43
Met 47
Pro 38
Pro 38
Met 44
Ile 64
Tyr 53
20
Actina-ATP
PDB 1HLU Resolució 2,65 Å
21
Actina-ATP centre dunió
22
Actina-ATP centre dunió
Arg183
Asp157
Lys18
Ser14
His73
23
Actina-ATP
Val 43
Met 44
Pro 38
Met 47
Ile 64
Tyr 53
24
Actina-ATP
Gly 42
Gly 46
Gly 48
25
ACTINAEstudi evolutiu
26
Estudi interespecífic dactines
Alineament basat en seqüència dactines de
diferents espècies
La seqüència aminoacídica de lactina està molt
conservada en diferents organismes eucariotes
!!!!!
27
Estudi interespecífic dactines
Alineament basat en estructura dactines de
diferents espècies
Sc 9.33 RMS 1.18 Å
28
Familia Actina/HSP70
Alineament basat en seqüència de diferents
proteïnes de la familia Actina/HSP70
La seqüència aminoacídica no està tant conservada
entre diferents proteïnes de la mateixa família
!!!!!
29
Familia Actina/HSP70
Superposició de diferents proteïnes de la familia
Actina/HSP70

• STAMP
• Sc 1.76
• RMS 4.16Å

• STAMP avançat
• Sc 0.82
• RMS 3.39Å

30
Familia Actina/HSP70
Superposició de diferents proteïnes de la familia
Actina/HSP70
Actina (2BTFA) HSP70 (1BUPA) Arp3 (1K8KA) Arp2
(1K8KB) MreB (1JCFA)

• Sc 1.84
• RMS 3.93Å

31
MIOSINA
32
MIOSINA

• Present a totes les cèllules eucariotes.
• Es desplaça al llarg dels filaments dactina.
• Constituïda per
• 2 còpies duna cadena pesada
• 1 cadena lleugera reguladora
• 1 cadena lleugera essencial
• Hi ha més de 40 tipus diferents ? Funció en la
  contracció muscular i daltres processos.

33
MIOSINA

• Classificació SCOP

• Domini motor
• CLASSE Alfa / Beta
• FOLD/PLEGAMENT NTPases amb braç P
• SUPERFAMÍLIA NTPases amb braç P
• FAMÍLIA Proteïnes motores

• Domini N-terminal
• CLASSE Tot beta.
• FOLD/PLEGAMENT SH3-like barril
• SUPERFAMÍLIA Domini N-terminal
• FAMÍLIA Domini N-terminal

• Cadena essencial
• CLASSE Tot Alfa.
• FOLD/PLEGAMENT EF hand-like.
• SUPERFAMÍLIA EF hand.
• FAMÍLIA Calmodulines

• Cadena reguladora
• CLASSE Tot Alfa.
• FOLD/PLEGAMENT EF hand-like.
• SUPERFAMÍLIA EF hand.
• FAMÍLIA Calmodulines

34
Estructura
PDB 1B7T Resolució 2,50 Å
35
Domini motor Subdominis principals
Subdomini U50
ß1
ß2
ß3
ß4
ß5
ß6
ß7
SH3 beta-barril
Subdomini L50
Domini convertidor
PDB 1MMD Resolució 2,00 Å
36
Domini motor Regió dinteracció amb lactina
Loop strut
Loop CM
Hèlix-loop-hèlix
PDB 1MMD Resolució 2,00 Å
37
Domini motor Regió dunió a nucleòtids
Switch 1
Loop P
Switch 2
PDB 1MMD Resolució 2,00 Å
38
Domini motor Canvi de conformació
Loop 4
Loop 3
Hèlix transmissora
PDB 1MMD Resolució 2,00 Å
39
Cicle Actina-Miosina
40
Lloc unió a nucleòtids
Conformació oberta
Conformació tancada
41
Confromació tancada
PDB 1MMD Resolució 2,00 Å
42
Conformació tancada Lloc unió a nucleòtids
43
Conformació tancada Lloc sortida del Pi
44
Conformació oberta
PDB 1MMA Resolució 2,35 Å
45
Conformació oberta Lloc unió a nucleòtids
46
Conformació oberta LLoc de sortida del Pi
47
Superposició oberta-tancada
PDB 1MMD/1MMA RMS 1,47 Å
48
Superposició oberta-tancada
49
Superposició oberta-tancada
50
Hidròlisi ATP
Hidròlisi ATP
51
Hidròlisis ATP
52
Transmissió del moviment
Moviment del braç
53
Transmissió del moviment
54
MIOSINAEstudi evolutiu
55
Estudi interespecífic de miosines
Alineament basat en seqüència de miosines de
diferents espècies
Loop P
Switch 1
La seqüència aminoacídica de la miosina està molt
conservada en diferents organismes eucariotes
!!!!!
Switch 2
56
Estudi interespecífic de miosines
Alineament basat en estructura de miosines de
diferents espècies
Switch 1
Loop P
Sc 6.26 RMS 1.91Å
Switch 2
57
Família Proteïnes motores
Alineament basat en seqüència de proteïnes
motores (miosines i kinesines) de diferents
espècies
58
Família Proteïnes motores
Alineament basat en estructura de proteïnes
motores (miosines i kinesines) de diferents
espècies
Domini convertidor
Switch 1
Loop P
Hèlix transmissora
Switch 1
59
Família Proteïnes motores
60
Súperfamilia Proteïnes loop-P
Alineament basat en seqüència de proteïnes de la
superfamília amb loop-P (amb centre actiu ATPasa)
de diferents espècies
61
Súperfamilia Proteïnes loop-P
Alineament basat en estructura de proteïnes de la
superfamília amb loop-P (amb centre actiu ATPasa)
de diferents espècies
Loop P
62
Súperfamilia Proteïnes loop-P
Sc 1,04 RMS 3,77
63
ACTINA-MIOSINA
64
Complex
Complex Actina-Miosina
MIOSINA 4
MIOSINA 3
MIOSINA 2
MIOSINA 1
FILAMENT ACTINA
PDB 1M8Q Resolució 70 Å
65
Complex Actina-Miosina
MIOSINA 1
MIOSINA 2
MIOSINA 3
RMS 1,57 Å
MIOSINA 4
66
Complex
Complex Actina-Miosina
ESTAT ATP ESTAT ADP
FLEXIBILITAT DE LA CUA HIDROFÍLICA
Sc 7,85 RMS 2,00 Å
ESTAT INICIAL ESTAT TRANSICIÓ
67
Complex
Complex Actina-Miosina
PDB 1M8Q Resolució 70 Å
68
Complex Actina-Miosina
69
Complex Actina-Miosina
LOOP 341-354
LEU 349
2,9 Å
ILE 535
ILE345
2,9 Å
HELIX-LOOP-HELIX
PHE 542
LOOP 144-148
70
Complex Actina-Miosina
LOOP 2
LOOP CM
1,97 Å
ZONA INTERACCIÓ ACTINA
71
Conclusions

• - Tant lactina com la miosina estan molt
  conservades a nivell de seqüència i estructura
  perquè són imprescindibles pel moviment.
• - Hem vist com tenen dominis estructurals
  conservats amb altres proteïnes, fet que demostra
  que determinats plegaments estructurals es
  repeteixen en diferents proteïnes per dur a terme
  una funció concreta.
• - El complex actina-miosina és molt dinàmic i
  complex.

72
Bibliografia

• Mary C. R. Visualizing myosins power stroke in
  muscle contraction. Journal of cell Science 113,
  3551-3562 (2000)
• Anne H., Vassilios N. K., Daniel H., Andrew G.
  S., and Carolyn C. Atomic Structure of Scallop
  Myosin Subfragment S1 Complexed with MgADP A
  Novel Conformation of the myosin head. Cell 97,
  459-470 (1999)
• Lawson J. D., Edward P., Ivan R., and Ralph G. Y.
  Molecular Dynamics Analysis of Structural Factors
  Influencing Back Door Pi Release in Myosin.
  Biophysical Journal 86, 3794-3803 (2004)
• Hiroshi K., Quantum Chemical Studies of the
  myosin ATPase Mechanism. J Nippon Med Sch 74,
  4-10 (2007)
• Li F. C., Hanspeter W., Michael K. R., Mary C.
  R., and Keneth A. T. Molecular modeling of
  averaged rigor crossbridges from tomograms of
  insect flight muscle. Journal of Structural
  Biology 138, 92-104 (2002)
• Elena P. S. and Robert J. F. Nucleotide switches
  in molecular motors structural analysis of
  kinesins and myosins. Current Opinion in
  Structural Biology 11, 716-724 (2001)
• Wolfgang K. and Kenneth C. H. The actin fold. The
  FASEB Journal 9, 167-174 (1995)
• Ludovic R. O, et al. The Crystal Structure of
  Uncomplexed Actin in the ADP State. Science 293,
  708-711 (2001)
• Philip G. and Roberto D. Crystal Structure of
  Monomeric Actin in the ATP State. The Journal of
  Biological Chemistry 278, 34172-34180 (2003)

73
Si teniu alguna pregunta ...
74
PREGUNTES PEM

• Respecte als filaments dactina assenyala la
  resposta correcta
• El monòmer dactina unit a ADP té poca afinitat
  per lextrem - del filament.
• El monòmer dactina unit a ATP es sent atret per
  lextrem del filament.
• Les dues anteriors són correctes.
• Un cop el monòmer es troba formant part del
  filament es produeix la hidròlisi de lATP.
• Totes són correctes
• Respecte el monòmer dactina, assenyala la
  resposta falsa.
• El monòmer dactina es pot subdividir en quatre
  subdominis.
• Els quatre subdominis conflueixen en la zona
  dunió del nucleòtid.
• Segons la classificació SCOP, pertany a la classe
  de proteïnes tot Beta.
• En el seu plegament es distingeixen tres capes de
  tipus Alfa/Beta/Alfa.
• Totes són correctes.

75
PREGUNTES PEM

• Respecte a les diferències entre actina unida a
  ATP i unida a ADP, assenyala la resposta
  correctes
• En els dos estats suneix el nucleòtid per la
  mateixa regió.
• Lestat unit ADP té un loop molt flexible al
  subdomini 2.
• En la zona dunió al nucleòtid intervé un ió de
  Clor.
• No es produeixen canvis conformacionals entre
  lestat dactina ADP i Actina ATP.
• En lestat ADP no hi ha intervenció de cap
  molècula daigua en la regió dunió al nucleòtid.
• Respecte a lestudi evolutiu de lactina,
  assenyala la resposta falsa
• La seqüència aminoacídica de lactina es troba
  altament conservada en els organismes eucariotes.
• Lestructura de lactina es conserva en diferents
  espècies eucariotes.
• Les dues anteriors.
• No es troba cap proteïna homòloga a lactina en
  organismes procariotes.
• Totes les anteriors.

76
PREGUNTES PEM

• En relació amb la miosina, indica totes les
  respostes que siguin correctes
• La funció principal de la miosina és desplaçar-se
  al llarg dels microtúbuls .
• En el domini motor de la miosina trobem la regió
  dunió a nucleòtids.
• En lestructura de la miosina no existeix cap
  cadena lleugera associada.
• El domini convertidor participa en el moviment
  del braç de la miosina.
• 1, 2, 3.
• 1, 3.
• 2, 4.
• 4.
• 1, 2 ,3, 4.

77
PREGUNTES PEM

• En relació amb el cicle actina-miosina, indica
  totes les respostes que siguin correctes
• La miosina la podem trobar en 4 estats
  principals.
• Existeixen diferents canvis conformacionals entre
  els diferents estats de la miosina.
• Quan es troba unit algun nucleòtid, el lloc
  dunió a nucleòtids de la miosina es troba
  tancat.
• En el procés de hidròlisi de lATP intervé una
  molècula de magnesi i una daigua importants.
• Totes les anteriors.
• Indica quina és la resposta falsa respecte
  lestructura de la miosina.
• En la zona dunió al nucleòtid trobem el Switch
  1, Switch 2 i Loop P.
• No hi ha relació entre el canvi de conformació en
  el lloc dunió a nucleòtids i el moviment del
  braç.
• En lestat obert es forma un tunel de sortida
  del Pi que sha generat per hidròlisis.
• Els residus que formen la butxaca dunió al
  nucleòtid tenen cadenes laterals molt simples
  (ex. Glicina).
• Lhèlix transmissora comunica el lloc dunió a
  nucleòtids i el domini convertidor.

78
PREGUNTES PEM

• En relació a lestudi evolutiu de la miosina,
  assenyala la resposta correcta
• El fet que la miosina sigui una proteïna
  essencial per la contracció muscular fa que la
  seva seqüència es trobi molt conservada al llarg
  de levolució.
• Les proteïnes motores (miosines i quinesines)
  conserven un lloc dunió a nucleòtids.
• Les dues anteriors.
• La miosina no té cap mena de relació estructural
  amb les proteïnes G.
• Totes les anteriors.
• Respecta a la interacció entre actina i miosina,
  assenyala la resposta correcta.
• Existeix un PDB de resolució molt bona que mostra
  el complex actina-miosina.
• La miosina interacciona amb lactina pel seu
  braç.
• La unió entre lactina i la miosina es tracta
  duna unió irreversible.
• La posició del braç de la miosina és sempre la
  mateixa quan està unida a lactina.
• Es dónen ponts dhidrogen làbils entre
  lestructura dactina i la de miosina.

79
PREGUNTES PEM

• Indica quina és la resposta correcta
• Les sequències aminoacídiques de lactina i de la
  miosina es troben molt conservades.
• Lactina i la miosina són molècules
  imprescindibles per a la contracció muscular.
• Lestructura tridimensional del complex
  actina-miosina sha obtingut mitjançant la
  tècnica de Tomografia dEmissió de Positrons.
• Les intericcions entre els residus de lactina
  amb els de la miosina estan molt ben definides.
• 1, 2, 3.
• 1, 3.
• 2, 4.
• 4.
• 1, 2 ,3, 4.