Eddig%20csak%20kvali%20volt...

1
Eddig csak kvali volt...

• Kvantitatív proteomika
• 1) a frakcionálás szintjén
• Pl. 2D gélek összehasonlítása vizuálisan,
  komputer programokkal, differenciál festéssel
• 2) az MS-analízis során

2
(No Transcript)
3
Az MS NEM kvantitatív módszer

• a különbözo molekulák nem egyformán
  detektálhatók
• pl. különbözo peptidek relatív intenzitása nem
  tükrözi relatív mennyiségüket
• nem minden komponenst detektálunk az
  elegyekbol

4
Hogy lehet ezt legyozni?

• csak nagyon hasonló peptidek relatív intenzitását
  vethetjük össze!
• 1) Jelöljünk két sejt-populációt hasonlóan, de
  megkülönböztethetoen!
• 2) Keverjük össze az összes fehérjét!
• 3) A keveréket emésszük, analizáljuk!
• És így kvantizhatunk!

5
Hogyan jelölhetünk?

• ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags)
  Cys-oldalláncának alkilezése, könnyu (H8) és
  nehéz (D8) alkil-csoporttal
• ? amiben nincs Cys, az kiesik
• ? a deuterált vegyület retenciós ideje kicsit
  hosszabb
• azonosítás MS-MS alapon
• kvanti MS-alapon relatív intenzitásokból
• ingadozás van az 30 is!

6
(No Transcript)
7
Hogyan jelölhetünk?

• SILAC (Stable Isotope Labeling with amino acids
  in Cell Cultures)
• C13, N15, O18
• tápanyaggal visszük be jelölt aminosav
• ? Olyat kell választani, ami nem alakulhat át más
  aminosavvá, illetve nem szintetizálódik a sejtben
• Tripszines emésztéshez Arg a meno!
• a keveréket frakcionáljuk, emésztjük,
  analizáljuk
• azonosítás MS-MS alapon
• kvanti a relatív intenzitásból

8
Hogyan jelölhetünk?

• tripszines emésztés H2O18-ban
• Két oxigén lép be, minden peptid jelölodik
• Rengeteg információ
• Még a szekvenálás is könnyebb, a C-terminális
  ionok csúsznak
• DE beszárítás a normál emésztés után, hosszú
  enzimes inkubáció...
• ? veszteségek, nem specifikus hasítások

9
Hogyan jelölhetünk?

• iTRAQ (Applied Biosystems)
• Nagyon ravasz jelölés!
• amino-csoportra (N-terminus, Lys)
• 4-féle stabil izotópos szerkezet, azonos additív
  tömeggel, de különbözo fragmensekkel (m/z 114,
  115, 116, 117)
• azonosítás és kvanti az MS-MS adatokból!

10
iTRAQ jelölés

• 4 mintát kvantitatíve megkülönböztetni.
• Minden peptidet jelöl, a módosítottakat is
• Egyszeru a mintaelokészítés
• Jelnövelo hatású (szuperponálódik a 4-féle jel)
• 20-nál kisebb standard deviáció
• Jobb minoségu CID spektrumok
• Poszt-transzlációs változásokat is lehet így
  mérni!

DRÁGA
Ross et. al. MCP 2004
11
Mi ebbol a tanulság?/Take home message

• Ha biológus vagy ? eredj programozást és
  statisztikát tanulni
• Ha matematikus vagy ? irány a biológia
• Ha proteomikával akarsz foglalkozni ?
  tömegspektrometria sem árt

12
Mi ebbol a tanulság?/Take home message

• Mennyiben lehet biológiai folyamatokat
  statisztikailag/matematikailag leírni?
• A komputer gyors, nem hibázik, tanulékony, de
  hülye...
• Mi emberek ellenben képesek vagyunk felismerni a
  váratlant, az újat feltéve, hogy használjuk az
  eszünket....

13
Minta kérdések

• Mitol függ, mennyire jó egy adatbázis?
• Mi az oka, hogy nincs tökéletesen muködo
  adatbázis-lekereso szoftver?
• Miért van szükség proteomikára?
• Miért kell jelölni kvantitatív proteomikában?
• Miért elonyös egy olyan jelölés, ami minden
  peptidet módosít? És valóban módosít-e minden
  peptidet?

14
Hasznos web-oldalak

• ProteinProspector http//prospector.ucsf.edu
• MS-BLAST - http//dove.embl-heidelberg.de/Blast2/m
  sblast.html
• BLAST - http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
• European Bioinformatics Institute -
  http//www.ebi.ac.uk/
• Szekvencia-összehasonlítás
• http//www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html
• MS kezdoknek - What is mass spectrometry -
  www.asms.org