TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

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TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Química Biológica Patológica
Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas

• IV- Parte

Tema1 (1)
? Dra. Silvia Varas svaras_at_unsl.edu.ar
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TIPO DE MUTACION

• DEFINE LA TECNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR A USAR
  PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

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Espectro de diferentes tipos de mutaciones en
genes humanos (Human Gene Mutation Database)
?Mutaciones sin sentido
? Mutaciones con cambio de sentido

• 14.363 mutaciones en 783 genes

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MUTACIONES PUNTUALES

• En la región regulatoria
• En el splicing
• Sin sentido (nonsense)
• Con cambio de sentido (missense)

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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular

• Grandes Deleciones
• Southern Blotting
• PCR Multiplex
• GAP-PCR
• MLPA

• Mutaciones Puntuales y deleciones pequeñas
• RFLP-PCR(ER-PCR)
• Mutagenesis mediada por PCR
• Alelo-Específicas
• MAS-PCR
• ARMS- MARMS
• DOT-ASO

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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular II

• Desconozco la mutación o polimorfismo
• SSCP
• (single strand conformation polymorphism)
• DGGE
• (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

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SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena
única)

• SSCP (single strand conformation polymorphism)
  es un método simple y accesible para detectar
  alteraciones en la secuencia en un fragmento
  obtenido por PCR

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SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena
única)

• La técnica de SSCP detecta variaciones en la
  secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros
  cambios pequeños) debido a la generación de
  diferencias en la movilidad electroforética.
• Bajo condiciones no desnaturalizantes, las
  moléculas de ssADN asumen conformaciones únicas
  que dependen de su secuencia de nucleótidos.
• Los cambios conformacionales producidos por
  variaciones en la secuencia de ADN pueden
  resultar en diferencia de movilidad detectables.

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1. Un par de primers específico es utilizado para
   amplificar el ADN blanco.
2. La muestra se enriquece en ssADN por medio de una
   PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de
   los primers en mayor cantidad que el otro.
3. Las movilidades de los fragmentos simple cadena
   se comparan mediante electroforesis en un gel
   neutro de poliacrilamida.
4. Las bandas son detectadas.

Rápido enfriamiento
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DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

• Los productos de PCR son cargados en un gel con
  un gradiente desnaturalizante
• Típicamente 20-80 formamida
• ADN doble cadena migra hasta encontrar su melting
  
• El melting es determinado por su secuencia y
  contenido de GC
• Las diferentes secuencias migran a diferentes
  distancias

20
80
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(No Transcript)
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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular

• Grandes Deleciones
• Southern Blotting
• GAP-PCR
• PCR Multiplex
• MLPA

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Tipos de Blots

• Southern Blot transfiere DNA y la sonda o probe
  es de ADN
• Northern Blot transfiere RNA y la sonda o probe
  es de ADN
• Western Blot transfiere proteínas y la sonda o
  probe son anticuerpos.

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(No Transcript)
15
The Southern blotting technique
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(No Transcript)
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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular

• Grandes Deleciones
• Southern Blotting
• PCR Multiplex
• GAP-PCR
• MLPA

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(No Transcript)
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(No Transcript)
20

• PCR Multiplex
• Es una variante de PCR en donde dos o más loci
  son simultáneamente amplificados en la misma
  reacción.

Cuidados especiales 1-Los primers de 18-24 pb
deben tener un contenido de GC 35-60 de esa
forma tiene una T anneling de 55-58ºC o
mayor. 2-Distribuir los amplicones de distintos
tamaños. 3-Diseñar primers con características
similares sin estructura secundaria ni
interacciones entre ellos. 4-Se debe calcular el
Tm (no muy diferentes entre primers) y analizar
las interacciones entre los primers).
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• PCR Multiplex

Cuidados especiales II 5- Se deberá optimizar
Tº extensión, Tiempo de extensión, Tiempo y
temperatura de anneling, número de ciclos,
cantidad de primers, concentración de dNTP y
MgCl2, uso de adyuvantes (glicerol, DMSO, BSA),
etc.
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(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular

• Grandes Deleciones
• Southern Blotting
• PCR Multiplex
• GAP-PCR
• MLPA

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GAP-PCR.

• Se utiliza un par de primers que flanqueen la
  zona delecionada (para el alelo mutado) y un
  primers ubicado sobre la deleción (para el alelo
  normal).
• Se generará dos productos de amplificación, el
  fragmento de menor tamaño se producirá a partir
  del alelo que presenta la mutación.

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Delecion African HPFH-2
M
N
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Estrategias en el laboratorio de Biología
Molecular

• Grandes Deleciones
• Southern Blotting
• PCR Multiplex
• GAP-PCR
• MLPA

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MLPA (múltiple amplificación de sondas
dependiente de ligación)

• Es una técnica basadas en una amplificación
  cuantitativa por PCR.
• Presentan la ventaja de permitir el análisis de
  hasta 40-50 secuencias blanco simultáneamente.
• Son técnicas muy usadas para detección de
  delecciones y duplicaciones del genoma.
• Se aplica a estudios en genética humana,
  citogenética e investigación en cáncer

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Instrumentos

• Un termociclador y un sistema de electroforesis
  tipo de secuencia son requeridos para MLPA
• Los resultados son obtenidos en 24 hs.
• Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un
  experimento

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Mix-Probes

• MLPA probes consiste de 2 oligonucleotidos
• La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y
  la sonda oligonucleotido derecha(RPO) (8)

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• Cada oligo a su vez contiene 2 partes
• El LPO contiene en su extremo 5 el F y en su
  extremo 3
• La secuencia de la sonda de hibridización
  izquierda (LHS).
• El RPO contiene en su extremo 5 la sonda de
  hibridización derecha (RHS) y el primer R en su
  extremo 3

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• Las sondas hibridizan de manera inmediatamente
  adyacente, de esta manera solo aquellos pares de
  sondas que encuentran sus secuencias blanco
  pueden ser ligadas y amplificadas por PCR.

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(No Transcript)
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Protocolo típico de MLPA
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Característica General

• La amplificación es de las sondas de MLPA, no de
  las muestra de ADN.
• El pattern de los picos son generadas sobre la
  muestras de un paciente y una muestra de ADN de
  referencia. Se compara la altura relativa de los
  picos. Las diferencias reflejan los cambios en el
  número de copias detectados por las probes de
  MLPA.
• Mas de 50 probes están presentes en una reacción
  de MLPA

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VENTAJAS de MLPA

• Detección de número de copias de 40-50 secuencias
  de ADN genómicos en una simple reacción, basada
  en PCR
• Requiere únicamente 20 ng de ADN humano (3.000
  células/0,5 ml de fluido amniótico).
• MLPA puede ser usado sobre Ms de ADN parcialmente
  degradadas tales como ADN extraído de tacos de
  tejidos parafinados.

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PROBLEMAS de MLPA

• Costo
• Necesidad de instrumental especifico

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Deleciones
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• Alguna pregunta?