Prezentace aplikace PowerPoint

1
PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ METABOLIZMUS
Studium primárního metabolizmu
Fotosyntéza, ovlivnení fotosyntézy vnejšími
podmínkami, asimilace N, inhibice produkty,
transport cukru, akumulace rezervních látek.
Studium a využití sekundárního metabolizmu

• syntéza sekundárních metabolitu (známo asi 30
  000 látek)
• biotransformace

Rostliny -- zdroj - potravy
- chemických látek
? Snaha o získání kultivací rostlinných
explantátu in vitro
2
Výhody kultivace in vitro

• nezávislost na sezónní promenlivosti (zkrácení
  doby)
• -- škudcích a chorobách
• -- geografických a politických
  omezeních
• možnost rídit produkci podle potreby
• -- zajistit stálou kvalitu produktu

Ale ??? rentabilita produkce ? nutnost
vysokých výtežku
3
Dva základní prístupy k dosažení produkce
sekundárních metabolitu

• produkce v suspenzní bunecné kulture
• imobilizace bunek rust a produkce po
  prodloužený casový úsek

Kultivace suspenzní bunecné kultury ? stálá
nezamýšlená selekce bunek s nejvyšší rustovou
rychlostí bunky malé, meristematické,
mitoticky aktivní
Syntéza sek. metabolitu NE! u rychle rostoucích
nediferencovaných bunek (casto je nutný urcitý
stupen diferenciace (morfologické, biochemické) ?
pomalejší rust
In vivo akumulace sekundárních metabolitu casto
ve vysoce specializovaných bunkách, ale pozor
!!, nekdy specifická místa slouží jen ke
skladování
Ztráta produkce pri dediferenciaci bunek ?
alternativa kultivace organizovaných kultur
korenové kultury
Pr. tkánové kultury za podmínek diferenciace
korenu ---- produkce atropinu
4
Dvoustupnová kultivace
1. stupen ---- pestování na udržovacím
(množícím) médiu
získání
dostatecného množství biomasy 2. stupen -----
pestování na produkcním médiu
indukce tvorby
sekundárního metabolitu
5
Udržovací X produkcní média
Zmena v mnoha složkách

• hormony asi nejduležitejší faktor rovnováha
  i koncentrace a typ, zejména
• auxinu a cytokininu
• minerální složení média nejvetší vliv N, P,
  duležitá koncentrace i typ NO3-, NH4,
• mocovina, aminokyseliny
• obvykle omezení zásobení N a P
  ? potlacení rustu ? zvýšení produkce

Pr. Morinda citrifolia ?? produkce
antrachinonu po ? koncentrace PO3- Pr.
Catharanthus roseus ?? produkce indolových
alkaloidu po ? koncentrace PO3-

• cukry ? konc. z 1-2 (udržovací médium) ? 5-10
  ? ?? produkce sek. metabolitu
• pH média
• organické prídavky

Pr. Nicotiana tabacum ?? produkce nikotinu po
snížení koncentrace NAA a KIN a vynechání
hydrolyzátu kaseinu
6

• stres - podmínky negativne pusobící na rust

• hormonální stres
• výživový stres (cukr, N, P, vzdušnení)
• chemický stres (antibiotika, težké kovy,
  elicitory)
• osmotický stres
• stres infekce (mikroorganizmy, viry)
• svetelný stres
• teplotní stres

?
?? produkce sek. metabolitu
Pr. ?? produkce karotenoidu, flavonoidu,
polyfenolu po ? ozárenosti
Pr. ??? produkce alkaloidu po ozárení modrým
svetlem
Pr. ??? produkce alkaloidu pri zmenách teploty
7
Velkoobjemové kultivace
Podmínky prumyslových kultivacních postupu
pestování obdobné mikrob. kultivacím
Ale !!! nekteré podstatné rozdíly
Mikrob. kultura
Rostlinná kultura

• Inokulacní denzita
• Rychlost rustu
• Citlivost ke strižnému napetí
• Morfologie kultury
• Požadavky na vzdušnení

malá velká malá jednotlivé bunky vysoké
velká malá velká shluky nízké
Rychlost rustu cas zdvojení 1-3 dny, experiment
trvá týdny ? problém sterility
Citlivost ke strižnému napetí velké rozmery
bunek,rigidní bunecná stena, vakuola ? nutnost
specifických míchacích zarízení
Uvolnování produktu problém (hromadení ve
vakuole) ? dvoustupnový postup hromadení-
uvolnování
8
Imobilizace

• možnost znovupoužití biomasy
• oddelení bunek od produktu
• dobré prostorové využití kultivacních nádob
• dosažení kontinuálního procesu

Produkce kapsicinu

• nutnost získání vyhovujících linií
• vhodná imobilizacní metoda
• uvolnování produktu do média

Metody imobilizace
Citlivost k mechanickému, osmotickému, výživovému
stresu, teplote , pH, O2 ? omezený výber
imobilizacních metod
Co se nehodí ? - poutání na povrch kovalentní
vazbou, zachycení do polyakrylamidu, vinylových
polymeru
Co se hodí ? -- alginát, agaróza, nosice -
nylon, nekdy polyuretan
Hlavní problém imobilizace difúze látek
Vytvorení mikroprostredí závisí na velikosti
cástic, porozite, míchání, koncentraci substrátu,
distribuci biomasy uvnitr partikulí
??!! Nekdy vhodné pro navození stresu
9
Pr. 1. prumyslove využívaná produkce šikonin.
Tradicní japonské lécivo a barvivo - producent
Lithospermum erythrorhizon v prírode obsah 1-2,
v kulturách in vitro 12-15
10
Pr. 1. prumyslove využívaná produkce šikonin.
Tradicní japonské lécivo a barvivo - producent
Lithospermum erythrorhizon v prírode obsah 1-2,
v kulturách in vitro 12-15
Pr Produkce sekundárního metabolitu lécivo
taxol 1969 - objeveno nové protinádorové
antibiotikum - taxol produkuje Taxus brevifolia
1983 1.fáze klinických testu v soucasnosti
jedno z nejduležitejších cytostatik,
prototyp nové rady antibiotik
Ale !!! K získání 1 kg taxolu je treba 700 900
kg kury tisu
? Snaha o produkci látky kulturami in vitro

• ? ? ? založení tkánových kultur ? ruzné typy
  primárních explantátu ? média ? rustové
  regulátory
• ? sacharidy ? antioxidanty ? adsorbenty
  fenolických látek ? svetelné podmínky ? teplota
  
• elicitace ? prídavky prekurzoru ? infekce
  Agrobacteriem ? ? ?

? Odvozeny linie s 40x vyšším obsahem taxolu než
je v kure T. brevifolia, suspenzní kultury
produkující 20 mg taxolu v 1l média
? 2002 zahájení komercní produkce taxolu
11
Pr. chinin Cinchona officinalis
antimalarikum
dogoxin Digitalis lanata
kardiotonikum morfin
Papaver somniferum
analgetikum thebain Papaver
bracteatum zdroj
kodeinu scopolamin Datura
stramonium snížení
krevního tlaku atropin Atropa
beladona
spasmolytikum steviocid Stevia
rebaudiana sladidlo
kapsicin Capsicum frutescens
lécivo jasmin
Jasminum spp.
parfém pyrethriny
Chrysanthemum cinerariaefolium insekticidy  
12
Pr Biotransformace digitoxin ? digoxin Obe
látky produkuje Digitalis lanata , ale úcinné
kardiotonikum je digoxin, rostlina produkuje
zejména digitoxin Zvládnuta biotransformace
digitoxinu suspenzními bunecnými kulturami nebo
imobilizovanými bunkami D. lanata
Pr Biotransformace steviol (aglykon) ?
steviocid, steviobiocid
Zvládnuta biotransformace steviolu suspenzními
bunecnými kulturami Stevia rebaudiana a Digitalis
purpurea