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Métodos de Recuento de Número y Masa de Células
Recuento Microscópico Directo Se mide un volumen
de una suspensión bacteriana que se ubica en un
área definida sobre el porta de un
microscopio. En el método de recuento de Breed
para bacterias de leche, por ej 0.01 ml de la
muestra se didtribuye en 1 cm2 del slide, se tiñe
para que pueda verse la bacteria, y se observa la
muestra con aceite en un objetivo de
inmersión. El área del campo de este objetivo se
puede determinar. Una vez que el nº de bacterias
se ha determinado en campos diferentes, se hace
un promedio de las bacterias vistas por campo. De
estos datos, el nº de bacterias en el cm2 donde
fue distribuida la muestra, se puede
calcular. Debido a que esta área del slide
contiene 0.01 ml de muestra, el nº de bacterias
en cada ml de suspensión es el nº de bacterias en
la muestra por 100. Se diseñó un slide especial
llamado Cámara de Recuento de Petroff Hauser.
(Fig. 1)
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(No Transcript)
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Fig. 1 Recuento microscópico directo con una
cámara de recuento de Petroff Hauser El nº
promedio de células dentro de un cuadrado se
multiplica por un factor de 1250000, que da el nº
de bacterias por ml. Es útil para ciertas
aplicaciones, pero tiene la desventaja de
requerir muestras con una alta población
microbiana, para que sea contable. Paso 1 Se
introduce un volumen conocido en forma
superficial sobre el slide especial del
microscopio inscribed con cuadrados de área
conocida y cubiertos con un cubre de vidrio
fino. Paso 2 Luego se llena con la suspensión
microbiana Pasos 3 y 4 El nº promedio de
bacterias en cada serie de estos cuadrados, se
calcula y luego se multiplica por un factor que
me da el recuento por ml. La mayoría de las
bacterias son difíciles de contar por este
método, y como sucede con otros métodos
microscópicos, las céluals muertas pueden
contarse como vivas. Otra desventaja, se
requieren concentraciones muy altas de células
para contar, alrededor de 10 6 por ml. La ventaja
es que es un método de recuento barato, no
necesita tiempo de incubación, y se lo reserva
para aplicaciones rápidas. Esta ventaja también
tienen los contadores electrónicos de células,
Contador Coulter, que cuenta automáticamente las
células en un volumen de líquido.
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Estos instrumentos se usan en algunos
laboratorios y en hospitales. Medidas directas
del crecimiento microbiano recuento de células
totales y viables El crecimiento de poblaciones
se mide estimando los cambios en el número de
células, en la cantidad de algún componente de
las mismas (por ejemplo, proteína) o en el peso
total seco de las células. Existen varios
métodos de contar el número de células o de
determinar la masa celular, adecuados para
diferentes organismos o diferentes situaciones
. Recuento de células totales El número de
células de una población se puede determinar
contando una muestra con el microscopio mediante
el método de recuento directo. El recuento
directo se puede hacer de dos formas, en muestras
secas sobre porta o en muestras líquidas. Con
muestras líquidas se emplean cámaras de recuento
especiales que, en esencia, son portas ltcavados
modificados, sobre cuya superficie de vidrio está
marcada una rejilla con pequeños cuadrados de
área conocida (Fig. 2).
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Fig. 2
Cada cuadrado de la parrilla puede contener un
pequeño volumen conocido, muy pequeño pero
determinado con precisión. En el microscopio se
puede contar el número de células por cada unidad
de área de la parrilla, lo que permite conocer el
número de células por el volumen que determina
cada área. La conversión de ese valor a número
de células por mililitro de la suspensión
original se hace fácilmente multiplicando por un
factor de conversión que depende del volumen del
tipo de cámara (Fig. 2).
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• El recuento directo por microscopía es un método
  rápido para conocer el número
• de células.
• Sin embargo, presenta ciertas limitaciones
• no distingue las células vivas de las muertas
• las células pequeñas son difíciles de ver con el
  microscopio y algunas posiblemente se pierden en
  el recuento
• en ocasiones la precisión es difícil

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• se require un microscopio de contraste de fases
  cuando las muestras no se tiñen
• el método no suele ser adecuado para suspensiones
  con baja densidad celular. Si una suspensión
  tiene menos de 106 células bacterianas por
  mililitro es posible que no se vean bacterias en
  el campo del microscopio. No obstante las
  suspensiones diluidas se pueden contar con más
  fiabilidad estadística si la muestra se concentra
  primero y se resuspende luego en un pequeño
  volumen
• las células móviles se deben inmovilizar antes
  del recuento.
• Recuento de células viables
• En el recuento microscópico directo se cuentan
  tanto células vivas corno muertas.
• En muchos casos interesa contar sólo las células
  vivas, y con este fin se han
• desarrollado métodos de recuento de células
  viables.
• Una célula viable se define como aquella que es
  capaz de dividirse y dar lugar a
• una descendencia y el método usual para realizar
  una determinación de células
• viables se basa en contar el número de células de
  la muestra que es capaz de
• formar colonias sobre un medio sólido adecuado.
• Por esta razón, el recuento de células viables
  también se llama recuento en placa
• o recuento de colonias.
• En este procedimiento se supone que cada célula
  viable puede formar una
• colonia.

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Estimación del Número de Bacterias por métodos
Indirectos No siempre se precisa contar células
microbianas para estimar su número. En la ciencia
y en la industria, los nº microbianos y la
actividad se determinan por métodos
indirectos. Turbidez Para algunos tipos de
trabajo experimental, estimar la turbidez es una
forma práctica de monitorear el crecimiento
bacteriano. A medida que las bacterias se
multiplican en un medio líquido, el medio se
vuelve turbio, por los aglomerados de células. El
instrumento que se usa para medir la turbidez es
un espectrofotómetro, un haz de luz es
transmitido a través de la suspensión de
bacterias a una celda fotoeléctrica. (Fig. 2) A
medida que el nº bacteriano aumenta, menos luz
llega a la celda fotoeléctrica. Este cambio de
luz se registrará sobre la escala del instrumento
como porcentaje de transmisión. O bien en una
escala logarítmica llamada absorbancia ( densidad
óptica. OD), que es un valor derivado del
porcentaje de transmisión. La absorbancia se usa
para graficar el crecimiento bacteriano.
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Fig.2
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Fig. 2 Estimación por turbidez del Número de
Bacterias La cantidad de luz que llega a un
detector del espectrofotómetro es inversamente
proporcional al nº de bacterias bajo condiciones
estandarizadas. Hay menos luz transmitida ,
cuando hay más bacterias en la muestra. Cuando
la bacteria está en crecimiento logarítmico ó
declina, un gráfico de A vs tiempo forma
aproximadamente una línea recta. Si las lecturas
de A se ajustan con las de recuento en placa del
mismo cultivo, se usa en estimaciones futuras de
números bacterianos obtenidos por medidas de
turbidez (curva de calibración). Alrededor de 10
a 100 millones de céluals se necesitan para que
la suspensión sea lo suficientemente turbia como
para ser leída en un espectrofotómetro. Por tanto
este método no es útil para medir la
contaminación de líquidos con un nº relativamente
pequeño de células. Actividad Metabólica Otra
forma indirecta para estimar el nº de bacterias
es medir la actividad metabólica de la población
de células. Este método supone que la cantidad de
un cierto producto metabólico como ácido ó CO2,
está en proporción directa al nº de bacterias
presentes. Ej los test microbiológicos que
detectan producción de ácidos para determinar
cantidades de vitaminas.
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Peso Seco Para organismos filamentosos, tales
como hongos, los métodos usuales son menos
satisfactorios. Un recuento en placa no mide el
aumento de la masa filamentosa. En recuento de
hongos, se cuenta el nº de esporas asexuales ,
pero esto a menudo no es una buena medida del
crecimiento. Se usa el Peso Seco. En este
procedimiento, el hongo se remueve del medio de
crecimiento, se filtra para remover el material
extraño, y se ubica en un weighing bottle, y se
seca en un desecador. Para bacterias, se sigue el
mismo procedimiento. Las bacterias usualmente se
remueven del medio de cultivo por centrifugación.
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Bibliografía

• Tortora, Funke, Case. Microbiology An
  Introduction. 6ta edición. Addison Wesley.1998