HYGIENE ET CONTR

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HYGIENE ET CONTRÔLE SANITAIRE DE LANIMALERIE
Nathalie Kapel Laboratoire de Parasitologie
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ANIMAUX DEXPERIMENTATION organismes
standardisés EXPERIMENTATIONS REPRODUCTIBLES

• MAINTIEN de la standardisation indispensable
• dans les unités délevage
• dans les animaleries

Mise en place dune BARRIERE SANITAIRE répondant
aux "lignes directrices relatives à l'hébergement
et aux soins des animaux" pour prévenir tout
développement infectieux (? pathologie
infectieuse)
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• Lanimalerie sera
• Séparée des autres laboratoires
• Munie de sas dentrée et de sortie
• Organisée avec un vestiaire séparé
• Avec couloirs séparés entrée/sortie
• Avec un système de ventilation autonome et
  contrôlé
• Avec des matériaux de surface étanche facilement
  lavable et désinfectable
• Avec des zones séparées de stockages des
  litières propres/nourriture et des déchets
• Dotées en congélateur(s), autoclave(s),bains
  germicide(s)..

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Paramètres qui influent sur lenvironnement de
lanimal et sources de contamination
DIRECTES/INDIRECTES
Transfert danimaux
Aliments/eau/litière
MACRO-
Température
Cage
Microenvironnement Facteurs génétiques
Hygrométrie
NH3 CO2
Lumière
ENVIRONNEMENT
Ventilation
Bruits
Personnel pathogènes animal ? homme
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• La prise en charge des animaux devra prendre en
  compte
• Objectifs expérimentaux
• Mode dhébergement
• Type dexpérience (aigue ou chronique)
• Présence déléments potentiellement contaminants
  (animaux ou matériels)
• Lexistence dagents interférents

Contrôle et Elimination
de toutes les variables autres que celle(s)
étudiée(s)
Aspect génétique, physique, chimique,
microbiologique
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HYGIENE et CONTROLE SANITAIRE en
expérimentation animale

• Mesures permettant le maintien des locaux et donc
  des animaux dans un état sanitaire satisfaisant
  
  Eviter la contamination des animaux
• Mesures vis-à-vis du personnel
  éviter
  la contamination des personnels animaliers et
  chercheurs (zoonoses, produits dexcrétion/sécréti
  on, infection expérimentales. )
  limiter le risque physique (bruit..) et chimique
  (solutions de nettoyage, désinfectants..)
  
  
• réduire le risque allergique (10 à 40 des
  personnels)
• Mesures permettant dassurer lintégrité de
  lenvironnement ISO 14000

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2 étape complémentaires

1. Contrôle ? traitement des entrées et sorties
2. Bio-nettoyage et désinfection des locaux
   et des équipements

PROPHYLAXIE SANITAIRE

• Rappel agrément de lanimalerie
• Contrôle du plan de nettoyage
• Contrôle des conditions dambiance

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SOURCES DE CONTAMINATION

• Transmissions directes
• Rongeurs sauvages (? quarantaine)
• Transferts danimaux (? isolateurs)

Animaux souvent contaminant avant le
développement dune symptomatologie clinique ou
biologique

• Transmissions directes
• Personnel manuportée (changement de gants à
  chaque cage ou portoir), vêtements
• Litière
• Matériel
• Alimentation, fluides
• Insectes
• Introduction de produits biologiques (sérum,
  lignée cellulaire.)

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1. CONTRÔLE DES ENTREES ET SORTIES

• Animaux
• Élevages contrôlés (certificat)
  
• (certificat de contrôle de létat sanitaire
  indispensable pour pouvoir
• faire voyager les animaux)
• envoi dans des conditions sanitaires
  contrôlées
• (boites avec filtres..)
• Animaux de récupération ? Quarantaine

Animaux transgéniques venant dunités de
recherche
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• Personnel
• Réservoir/vecteur potentiel dagents infectieux
• Bras/mains/poumons sources de contact et/ou
  contamination

• LIMITATION DES ACCES
• RESPECT DES BPL
• VETEMENTS PROTECTEURS
• Blouses
• Gants en cas de contact direct avec des
  toxines,
• du sang, des matières infectieuses ou des
  animaux infectés
• ? Chaussures de travail
• ? Masques

• risque
• infectieux

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? Prévoir un endroit pour suspendre les
vêtements protecteurs ? Prévoir un espace près
de la sortie pour un panier à linge (vêtements de
laboratoire à stériliser avant blanchissage avec
détergents/désinfectants) OU vêtements à usage
unique coût vs infection ? Installations pour
le lavage des mains dans lanimalerie
(actionnée/pied ou genou ou commandes
automatiques)
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• Aliments
• Contrôle systématique des fabrications mais
  risque de contamination lors du stockage
• Stockage dans des locaux aérés et frais
• Locaux protégés contre les insectes / rongeurs
• Durée de stockage limitée

• Matériels dexpérimentation
• contrôlé et stérilisé si possible
• Matériels biologiques
• ? contrôlé si possible au plan infectieux avant
  introduction dans lanimalerie (intérêt des MAP
  test)

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Air/Ventilation Aérosols particules internes
(solide/liquide) ou viables (virus/bactéries/spore
s) Origine mécanique ou humaine ()
Facteurs de dissémination des substances
dangereuses Danger potentiel pour le personnel
et lenvironnement (105 à 107 particules gt 0,5
µm/mn émises lors de la parole et de la
desquamation cutanée)
Les locaux d'hébergement doivent disposer d'un
système de ventilation approprié aux exigences
des espèces hébergées (niveau de confinement) ?
fourniture dun air pur ? ? odeurs, gaz
toxiques, poussière et agents d'infection ?
élimination de la chaleur et de l'humidité
excessives tout en évitant les courants d'air
nocifs renouvellement 8 à 20 volumes/heure
selon la densité d'animaux hébergés
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Taille des Aérosols
Invisible Visible
Mol. Gazeuses Brouillard Bruine Pluie
Fumée de tabac Fumée de tabac
Fumée / Poussières industrielles Fumée / Poussières industrielles
Virus Bactéries/champignons Virus Bactéries/champignons
Spores
0.00001µm 0.001 µm 0.01 µm 0.1 µm 1 µm 10 µm 100µm
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Temps de chute en air calme des particules
sphériques de densité 1
Diamètre Temps de chute dune hauteur d1 m Longévité
100 µm 10 µm 1µm qq secondes 5 minutes 9 heures Aérosol temporaire
0.1 µm 0.01 µm 38 jours 10 ans Aérosol permanent
0.001 µm 0.0001 µm Aérosol permanent
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Effluents respects de lenvironnement
maintien des barrières de confinement
biologique dans tous les systèmes dévacuation et
délimination

• Les producteurs de déchets sont tenus de
  sassurer que toutes les étapes du transport et
  de lélimination des déchets seffectuent en
  toute sécurité et en conformité avec la loi.
• ? Sans risque de prolifération de la vermine
• ? Sans diffusion des odeurs
• ? Sans dissémination des agents infectieux
• ? Sans contamination de lenvironnement
• ? Par une sortie exclusivement réservée

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Déchets non contaminés ? ordures
ménagères ? stockés dans un local fermé et
élimination

• Déchets biomédicaux solides (cadavres
  danimaux, produits biologiques.)
• ? stocker dans un congélateur puis éliminés dans
  des fûts hermétiques stockés dans un
  local fermé
• ELIMINATION/INCINERATION PAR DES SOCIETES
  SPECIALISEES

Déchets biologiques et chimiques liquides ?
éliminés dans des bonbonnes hermétiques stockées
dans un local fermé NEUTRALISATION /
TRAITEMENT PAR DES ENTREPRISES SPECIALISES
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2. ENTRETIEN DES INSTALLATIONS

• BIONETTOYAGE
• DETERSION DESINFECTION
• procédés destinés à réduire momentanément la
  biocontamination dune surface
• propreté physique ET microbiologique
• Le souvent 0 germes pathogènes
• ? destruction des possibilités de développement

Agents pathogènes bactéries, virus, spores de
moisissures 0 destruction si protégés par des
particules organiques
!!! Des mesures sanitaires adéquates ne
compenseront pas le transfert
dinfection par le personnel !!!
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DETERSION/NETTOYAGE étape préalable
indispensable à la désinfection
But Éliminer dune surface ou dun objet tous
déchets, souillures, fibres, particules par TOUS
les moyens nécessaires sans détériorer le matériau
Efficacité respect des 4 éléments du cercle de
Sinner
Action physico-chimique entre le produit et la
salissure
La température
Action mécanique par brossages et frottements
afin de décoller la salissure
Le temps daction du produit nécessaire pour que
le produit soit efficace
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1. Les locaux entretien facilité par
lexistence de revêtements adaptés
Corridors et aires de services et pièces
dhébergement des animaux balayage lavage
avec utilisation de solutions détergentes
adaptées ? Régulier (gt 1/semaine) ? après les
changements de litière ? Après les manipulations
importantes Eviter le lavage à grande eau qui
perturbe les animaux et dérègle les systèmes de
climatisation Eviter lutilisation daspirateur
aérosols
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2. Le matériel portoirs, cages, biberons Lors
du changement de litière Réalisé aussi souvent
que nécessaire pour que les animaux propres et
secs et avec un taux acceptable dammoniaque dans
les cages Fréquence à définir en fonction - de
lespèce, de la taille des animaux - de la
densité de la population - du type de cage - de
la présence de portées - de laction des
substances en essai sur les fonctions digestives
et urinaires

• Lavage du matériel dans un local séparé
• pré-rinçage à leau chaude
• ? détergeant acide (dépôts calcaires) rinçage
• solution détergente (souvent alcaline) rinçage

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Produits utilisés détergents à haut pouvoir
dégraissant (personnel protégé blouses, gants,
? lunettes)

• Savon ordinaire
• Emploi peu commode et incompatibilité avec les
  NH4 IV
• Substances tensio-actives (détergents
  anioniques, cationiques ou amphotères)

!!! Contaminations rétrogrades !!!
? Ouverture de portes (changement de circulation
dair) ? Pièces déquipement mobiles
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DESINFECTION
Définition AFNOR Opération au résultat momentané
permettant déliminer ou de tuer les
micro-organismes et/ou dinactiver les virus
indésirables portés par des milieux inertes.
? Le résultat de cette opération est limité aux
micro-organismes présents au moment de
lopération.

• Tous les désinfectants
• ont besoin de TEMPS pour être efficaces
• sont actifs sur des surfaces PROPRES
• sont dautant efficaces que les LOCAUX sont
  ADAPTES

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• Qualités à exiger pour un désinfectant
• Efficacité (spectre daction adapté aux
  contaminants potentiels bactéries pathogènes,
  bactéries saprophytes indésirables, bactéries
  sporulés, parasites, virus, champignons) et
  constance de laction même en présence de
  substances interférentes
• Innocuité pour les objets soumis à désinfection
  et pour le manipulateur, Stabilité du produit
  dorigine et du produit dilué connues
• Rapidité daction et rémanence
• Simplicité (Souplesse du mode dapplication avec
  propriétés mouillantes détergents
  désinfectants)
• Bas prix de revient

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• Sélection du produit selon lutilisation
• Désinfection des surfaces sols, murs, plafonds
• Désinfection matériel cages, petit matériel
• Antisepsie du personnel lavage des mains,
  douche

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Les désinfectants chimiques
1. Dérivés halogénés (hypochlorite de soude)
Efficacité sur la plupart des
micro-organismes Eau de javel titre minimum
3,8 12 chlorométrique Désinfection de
surfaces propres dilution au 1/10,
10mn Désinfection de surfaces au laboratoire
dilution au 1/8, 10mn

• 2. Aldehydes (souvent associés aux NHIV) action
  lente
• Formol bactéricide à forte concentration (G-)
• sporicide si action prolongée
• fongicide
• virucide si action prolongée (action lente
  sur virus nus)

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• 3. Ammonium IV
• Pouvoir détergent nombreux détergents-désinfectan
  ts
• bactériostatiques sur G- et bactéricide sur G
• Activité variable sur virus enveloppés, 0 sur
  virus nus
• Non sporicide
• Fongistatiques

!!! Incompatibilité avec les dérivés halogénés,
anioniques et phénoliques !!! ? activité par
matières organiques et eau dure ? activité par la
chauffage et un pH ?7
4. Dérivés alcooliques bactéricides virucides
variables non sporicides
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5. Agents oxydants (acide péracétique, peroxide
dH2) bactéricides virucides fongicides ?
Activité par matières organiques ? Activité à pH
acide
6. Biguanides type chlorhexidine
bactéricides non virucides non
sporicides fongicides sur C. albicans !!!
Incompatibilité avec les dérivés anioniques !!! ?
activité par matières organiques et eau dure

• Ne pas mélanger 2 produits mais alternance
  possible ET CONSEILLEE

29
(No Transcript)
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• ? concentration en principe actif
• ? concentration risque de sélection d'1 souche
  pathogène
• Ex Cétrimide (Cetavlon) présent dans le milieu
  sélectif du Pseudomonas
• ? temps de contact
• ? température
• ? pH
• dérivés chlorés plus actifs en milieu acide
• ammonium IV plus actifs en milieu alcalin
• ? présence dinhibiteurs
• détergents anioniques
• inhibiteurs des ammoniums IV
• matières organiques,
• eau dure

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Les désinfectants physiques
1. Chaleur humide ( autoclave) Recommandée pour
les objets inertes Stérilisation par
contact objet/vapeur ? objet enfermé dans un
récipient étanche non stérile ? en cas de
flacon contenant un liquide, le temps de
stérilisation est compté à partir du moment où le
liquide atteint la T de stérilisation
Pression (atm) T débullition de leau
1 100C
1,5 112C
2 121C (20 mn)
3 135C
32
(No Transcript)
33

• 4. UV radiations 2500-2600Å
• action photochimique
• ? Efficace en surface car faible pouvoir de
  pénétration
• Efficace sur matériaux à bon coef. de réflexion
  tel laluminium poli (0,7-0,8) (acier inoxydable
  ? 0,2-0,3)
• Efficacité sur unicellulaires
• ex 25µW/mn/cm2 bactéries
• 30 000 µW/mn/cm2 algues vertes
• longévité limitée des lampes UV
• (2000-15000h selon nombre dinterruptions ?
  remplacement à 3000h)
• ? efficacité ? par la salissure (jusquà 80)
• Utilisation pour les SAS entré/sortie ? 30 mn
• la nuit en complément

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Les méthodes de désinfection

• Matériel
• bain germicide installé derrière la barrière
  sanitaire pour la stérilisation du matériel
  destiné à la zone protégée
• extérieur des flacons contenant des produits
  thermosensibles, outils, instruments
• Formol, alcools, chlorure de benzalkonium
• chaleur humide (autoclave)
• ? chaleur sèche (four poupinel)

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• 2. Locaux
• rayonnement UV l germicide (nettoyage
  préalable)
• sas, pièces dexpérimentation..
• pulvérisation germicide NH4 IV (propriétés
  mouillantes)
• matériel
• vapeur de formol ? trioxyméthylène
• gaz incolore et irritant, soluble dans leau, d
  ? 1
• (obturation hermétique du local et arrêt de
  la ventilation)
• désinfectant de surface (0 en profondeur)
• ? pénétration et ? pouvoir bactéricide en
  présence de vapeur deau et T
  gt20C (opt 24-30C) et humidité ? 80)
• action bactéricide en 20-50 mn (conc 1g/m3)
  en absence de
  particule organique
• Aération du local après action (ne pas oublier le
  circuit de gaines !)
• Délai avant ré-intégration 48h

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3. CONTRÔLE DE LA DESINFECTION? contrôle des
produits désinfectants

• 0 norme ou méthode standardisée
• mise en œuvre/validation par les utilisateurs
  des procédures
• ? surveillance physique densité en particules
• faible corrélation entre contamination
  microbienne et particulaire
• faible reproductibilité en zone non contrôlée
• surveillance microbiologique AIR/SURFACES
• Ensemencement de milieux gélosés (passif,
  impacteur, écouvillon)
• bon reflet de laérocontamination à instant
   t 
• délai, coût

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• ? utilisation danimaux sentinelles
• animaux de statut sanitaire définis introduits
  dans lanimalerie
• (même souche/origine que les animaux
  dexpérimentation)
• Hébergement en cage sans couvercle filtrant
• évaluation de leur état sanitaire microbien,
  virologique... après une période de 15 à 30 j
• Nempêche pas le contrôle sanitaire à partir
  déchantillons biologiques et des data cliniques

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CONTRÔLE SANITAIRE DES ANIMAUX

• OBJECTIF Validation de létat E (I)OPS/SPF
• sassurer de labsence dorganisme pathogène
  pouvant
• ? provoquer une maladie chez lanimal
• (animal stressé plus réceptif à
  lexpérimentation)
• modifier les résultats expérimentaux résultats
  biologiques, développement de tumeurs, réponses
  immunitaires, cellulaires...
• ? représenter un risque de zoonose

maintien de létat sanitaire validé par
léleveur !
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• Différentes catégories dagents infectieux
• agents infectieux principaux
• pathologies modifiants les processus métaboliques
• processus diagnostics
• élimination par production sous barrière
• Ex virus Sendai, virus de lhépatite de la
  Souris, Salmonelles
• agents infectieux opportunistes
• communs dans lenvironnement
• peu pathogènes (animaux immunodéprimés, délai de
  latence)
• élimination ? contact animal/humain
• Ex Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
• ? agents infectieux divers
• rôle limité comme pathogène/opportuniste

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• Sélection des microorganismes à contrôler (1)
• Comparaison liste optimale/moyen de diagnostic
• prévalence des agents
• coût
• agent pathogène de lanimal avec risque de
  zoonoses
• pouvoir pathogène démontré à lorigine
  dépidémies cliniquement/biologiquement évoquées
  ou agent opportuniste (agents opportunistes
  incidence faible mais forte mortalité)
• interactions documentées avec les processus
  métaboliques, physiologiques, immunologiques,
  tumoral
• agent ubiquitaire dans lenvironnement ou associé
  à la flore normale de lHomme
• validité des méthodes de détection
  sensibilité/spécificité sérologie pour
  virus (sensible, rapide peu coûteux)
  cultures bactériennes et
  virales (sensibilité ?)
• possibilité de traitement ou euthanasie des
  animaux et formolisation de lunité

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• Sélection des microorganismes à contrôler (2)
• Situation idéale définis par les utilisateurs
  des besoins
• statut des animaux
• risques dinteractions avec les processus étudiés
  (métaboliques, physiologiques, immunologiques,
  tumoral )
• risque spécifique lié à lintroduction de
  matériel biologique intérêt des MAP tests
• validité des méthodes de détection
  sensibilité/spécificité
• traitement possible ou euthanasie des animaux et
  formolisation de lunité
• coût

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• recommandations relatives au contrôle sanitaire
  dans les unités délevage par la FELASA
  (Fédération des Associations Européennes pour la
  Science de lAnimal de Laboratoire)
• concernent
• toutes les espèces souris, rats, hamsters,
  cobayes, lapins..
• toutes les souches de lunité délevage
• résultat ? 0 microorganisme chez les animaux
  testés
• (? élevage)
• résultat ? présence du microorganisme/Ac
• résultats ultérieurs ? jusquà éradication
• pas dobligation de tests ultérieurs si résultat
  rendu positif

• programmes de contrôle de routine avec
  prélèvements réguliers
• ? programme de diagnostic rétrospectif

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• Fréquence des contrôles
• statut sanitaire de la population à linstant
  t
• ? contrôles ? confiance sanitaire
• f(sensibilité des tests)
• f(infrastructure, mode dhébergement)
  isolateurs, cages ventilées.
• f(qualité hygiène/désinfection)
• f(fréquence dintroduction de nouveaux animaux)
• f(introduction déchantillons biologiques)
• f(données biologiques) Ac

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NORMES FELASA
Souris, Rats, Hamsters
fréquence échantillons Age nb danimaux séro. bact. para. anapath
tous les 3 mois sevrage ? 2 -
tous les 3 mois jeunes adultes ? 2
tous les 3 mois anc. Reproducteurs ? 2
Lapins
fréquence échantillons Age nb danimaux séro. bact. para. anapath
tous les 6 mois jeunes adultes ? 4
tous les 6 mois anc. reproducteurs ? 4
Contrôle des animaux au quotidien appétit,
aspect du poil, comportement social
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Echantillonnage Échantillon
N danimaux sains 0,05 intervalle de
confiance de 95 Conditions population de
taille suffisante (gt 100) dispersion
aléatoire 0 sex ratio ni autres facteurs de
sélection prévalence connue (littérature)
Incidence prévue () dans la population Échantillons à tester
90 2
50 5
10 29
1 298
46
NORMES FELASA contrôle sérologique
Virus dans les contaminations ou infections
rencontrées chez les animaux de laboratoire en
élevage ou en expérimentation
résultats douteux ou inattendus ? contrôles par
une technique ? résultat () présence dAc chez
un ou plusieurs animaux, rendus () jusquà
éradication
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NORMES FELASA contrôle bactérien et fongique
(1)

• Connaissances ? stable quant à lexistence de
  nouveaux pathogènes
• ? moyens connaissance/dépistages quelques
  nouvelles espèces
• ex Helicobacter ? histologie/culture/sérologie/P
  CR
• Diagnostic actuellement exceptionnel chez les
  rongeurs élevés sous barrière sauf opportunistes
  et animaux immunodéprimés
• liquides de rinçage du nez ou du nasopharynx, de
  la trachée, du prépuce/vagin, du
  caecum, et sérum
• culture sur milieux non sélectifs et enrichis
• sérologies
• anatomie-pathologie

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NORMES FELASA contrôle bactérien et fongique
(2)
Résultats () cf sérologie Dautres
microorganismes peuvent être recherchés en
fonction des lésions, des signes
cliniques, des modifications de certains
paramètres physiologiques ou biologiques et des
conditions délevage
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NORMES FELASA contrôle parasitologique

• Connaissances stables quant à lexistence de
   nouveaux parasites  pathogènes.
• Diagnostic exceptionnel chez les animaux élevés
  sous barrière
• examen du pelage
• examen à létat frais du contenu caecal et de la
  paroi interne de liléon
• examen parasitologique du contenu fécal
• arthropodes
• helminthes
• Eimeria sp.
• Giardia sp.
• Spironucleus sp.
• autres flagellés
• Klossiella sp.
• Encephalitozoon cuniculi
• Toxoplasma gondii
• Trichosomoides crassicauda

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NORMES FELASA contrôle anatomopathologique

• Prélèvement des organes à lautopsie de routine
• peau
• cavité buccale
• glandes salivaires (rat)
• appareil respiratoire
• aorte (Lapin)
• coeur
• foie
• rate
• tractus gastro-intestinal
• reins
• glandes surrénales
• tractus uro-génital
• ganglions lymphatiques
• tous les animaux suspects ou malades

51
(No Transcript)