1
La detección mediante pirosecuenciación de
variantes minoritarias del VIH resistentes no
condiciona el fracaso virológico en pacientes que
empiezan tratamiento antirretroviral con fármacos
de barrera genética baja.

• Beatriz Hernández Novoa
• Enfermedades Infecciosas
• Hospital Ramón y Cajal

2
Agradecimientos

• Santiago Moreno
• Carolina Gutiérrez y Carmen Page
• Fernando Dronda, Pepe Casado, Susi Pérez-Elías y
  Ana Moreno
• Fundación MM
• Roche Mayte Garcia, Miguel Alvarez
• LifeSequencing (Valencia) Laia Pedrola
• Era7 (Granada) Marina Manrique y Eduardo Pareja

3
Determinación de resistencias al tratamiento
antirretroviral

• La secuenciación poblacional sólo detecta
  subpoblaciones que representen un 20-25 de la
  población viral

4
Detección de variantes minoritarias

• Técnicas ultrasensibles
• Detectan poblaciones minoritarias resistentes
  (0,05)
• Distintos fundamentos y plataformas (PCR-alelo
  específica, secuenciación clonal, secuenciación
  masiva)
• Grandes avances técnicos.pero
• No determinado implicación de la detección de
  estas variantes minoritarias en la respuesta
  terapéutica

5
Nature 437376-380 (2005)
6
The Genome Sequencer-FLX System
Close and Press GO! sequence genome
7
Picotiter plate
8
GS-FLX Series Titanium technology
www.roche-applied-science.com
9
Key Concept454 Sequencing from individual DNA
molecules
10
Sequencing WorkflowSequencing by Synthesis

• Bases (TACG) are flowed sequentially and always
  in the same order across the PicoTiterPlate
  device during a sequencing run.
• A nucleotide complementary to the template strand
  generates a light signal.
• The light signal is recorded by the CCD camera.
• The signal strength is proportional to the number
  of nucleotides incorporated.

11
GS FLX DataImage Processing Overview
12
GS FLX DataFlowgram Generation
Flowgram
TACG
4-mer
Flow Order
3-mer
T T C T G C G A A
2-mer
1-mer
Key sequence TCAG for signal calibration
13
Direct amplicon sequencingPCR from genomic DNA
using fusion-primers
14
emPCR ensures clonal amplification sequencing
(no subcloning needed)
15
Antecedentes

• En los últimos años ha habido grandes avances en
  el desarrollo de técnicas ultrasensibles para
  detectar variantes minoritarias de VIH
  resistentes.
• Asímismo, se ha realizado muchos estudios para
  determinar la prevalencia o la cinética de
  aparición de estas variantes minoritarias en
  distintos contextos.
• Los fármacos de barrera genética baja representan
  el escenario ideal en el que las variantes
  minoritarias puedan afectar al efecto de la
  terapia antirretroviral.

16
Antecedentes

• Desafortunadamente existen publicados pocos
  estudios bien diseñados que evaluen el impacto
  clínico de las variantes minoritarias mutadas del
  VIH en pacientes que empiezan tratamiento
  antirretroviral con fármacos de bararera genética
  baja, y los resusltados son poco consistentes,1-6
  por lo que el papel de estas variantes aun no
  está completamente establecido.
• Entre las técnicas disponibles de genotipado
  ultrasensible, la pirosecuenciación es más
  versatil, rápida y permite procesar
  simultáneamente más muestras que la PCR
  aleloespecífica o la secuenciación clonal.

17
Literatura citada

• Metzner KJ, Giulieri SG, Knoepfel SA, et al.
  Minority quasispecies of drug-resistant HIV-1
  that lead to early therapy failure in
  treatment-naive and -adherent patients. Clin
  Infect Dis. Jan 15 200948(2)239-247.
• Johnson JA, Li JF, Wei X, et al. Minority HIV-1
  drug resistance mutations are present in
  antiretroviral treatment-naive populations and
  associate with reduced treatment efficacy. PLoS
  Med. Jul 29 20085(7)e158.
• Peuchant O, Thiebaut R, Capdepont S, et al.
  Transmission of HIV-1 minority-resistant variants
  and response to first-line antiretroviral
  therapy. Aids. Jul 31 200822(12)1417-1423.
• Coovadia A, Hunt G, Abrams EJ, et al. Persistent
  Minority K103N Mutations among Women Exposed to
  Single-Dose Nevirapine and Virologic Response to
  Nonnucleoside Reverse-Transcriptase
  Inhibitor-Based Therapy. Clin Infect Dis. Jan 9
  2009.
• Martinson NA, Morris L, Johnson J, et al. Women
  exposed to single-dose nevirapine in successive
  pregnancies effectiveness and nonnucleoside
  reverse transcriptase inhibitor resistance. Aids.
  Mar 12 2009.
• Simen BB, Simons JF, Hullsiek KH, et al.
  Low-abundance drug-resistant viral variants in
  chronically HIV-infected, antiretroviral
  treatment-naive patients significantly impact
  treatment outcomes. J Infect Dis. Mar 1
  2009199(5)693-701.

18
Objetivo

• Evaluar la participación de variantes
  minoritarias mutadas del VIH en la respuesta al
  tratamiento en pacientes naïve que iniciaban TAR
  con fármacos de barrera genética baja.

19
Pacientes y métodos

• De entre los pacientes de la consulta monográfica
  de VIH se seleccionaron 15 según los siguientes
  criterios de inclusión
• Genotipado estándar basal salvaje mediante
  secuenciación poblacional.
• Muestra basal de archivo disponible (-80 ºC).
• Inicio de TAR con fármacos de barrera genética
  baja (3TC, EFV, NVP) con buena adherencia
  documentada por cuestionario autocumplimentado y
  registro de dispensación de farmacia.
• Carga viral detectable a los 6 meses de inicio
  del TAR.

20
Pacientes y métodos

• Diseñamos un fragmento de PCR que englobara las
  principales mutaciones que afectaban a los
  fármacos de barrera genética baja a estudio
  (K103N, Y181C and M184V) (Fig. 1).
• Los primers se marcaron para identificar a cada
  paciente por individual permitiendo la
  secuenciación masiva simultánea de las 15
  muestras enuna única placa de PicoTiter,
  abaratando costes (Fig. 1).
• Se añadió a los primers marcados la secuencia de
  los primers de fusión para permitir la PCR en
  emulsión y la posterior pirosecuenciación
  mediante el Genome Sequencer 20 system
  (454LifeSciences-Roche) (Lifesequencing,
  Valencia).

21
Resultados
22
Resultados
23
Resultados
Paciente reads usadas reads descartadas reads totales reads forward reads reverse
2031 9578 732 10310 4537 5773
2032 1830 150 1980 970 1010
2033 2705 274 2979 1416 1563
2035 9624 802 10426 5024 5222
2036 6791 946 7737 3718 4019
2037 2479 185 2664 1330 1334
2038 2142 245 2387 1188 1199
2039 3505 286 3791 1940 1851
24
Resultados

• Todos presentaron variantes minoritarias
  resistentes en alguna medida
• La proporción media de variantes minoritarias
  resistentes de VIH-1 presentes al inicio de
  tratamiento fue de
• K103N (AAC y AAT) 3.63 (0.05-12.70)
• Y181C 0.00 (0.00-0.11)
• M184V 3.63 (0.45-11.93)
• La CV basal media fue 5.0 log (3.8-5.7)
• Se alcanzó CV indetectable (lt1.7 log) tras la
  administración del tratamiento en todos los casos
  menos uno, en un tiempo medio de 9.1 meses
  (4.0-12.0).

25
Resultados
Incluye ambos codones mutados (AAC y AAT).
26
Resultados

• El genotipado estándar del único paciente que no
  alcanzó CV indetectable, en el momento del
  fracaso
• presentaba las mutaciones K103N y M184V
• (TAR ddI 3TC EFV)
• habían sido detectadas como variantes
  minoritarias basalmente
• en una frecuencia no superior a la de otros casos
  en los que sí hubo respuesta al TAR

27
Conclusiones

• En conclusión, a pesar de que se detectaron
  variantes minoritarias asociadas a resistencia a
  fármacos de barrera genética baja (3TC, EFV y
  NVP) incluidos en el régimen inicial, sólo se
  documentó fracaso virológico en un caso.
• En el resto de pacientes se alcanzó CV
  indetectable, si bien con cierto retraso.
• En nuestra experiencia, y empleando una técnica
  con un nivel de sensibilidad inferior al 0.05,
  la presencia de variantes minoritarias de VIH-1
  resistentes a fármacos de barrera genética baja,
  sólo condicionó el fracaso virológico en 1/15
  casos (6,7).

28
Conclusiones

• Además, en este caso la proporción de variantes
  minoritarias presente fue significativamente
  menor que la observada en muchos casos en los que
  sí se obtuvo CV indetectable.
• El número de pacientes que hemos estudiado es
  bajo, pero no menor que el de estudios similares
  publicados.

29
Gracias!!!!!!
30
(No Transcript)