Obten

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de
Desenvolvimento Tecnológico CDTec Curso de
Graduação em Biotecnologia

• Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica

Prof. Luciano Pinto
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Característica das Proteínas
Caroline Rizzi/Luciano
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Caroline Rizzi/Luciano
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Ponto Isoelétrico
É no ponto isoelétrico que a proteína
apresenta-se com menor solubilidade!!!!
Caroline Rizzi/Luciano
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Importância do cálculo do pI

• 1.Vector NTI
• 2.Expasy
• Focalização isoelétrica
• Solubilidade
• Purificação
• Proteínas ácidas
• pHgtpI troca iônica
• Proteínas básicas
• pHltpI troca catiônica

Caroline Rizzi/Luciano
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Caroline Rizzi/Luciano
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Caroline Rizzi/Luciano
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(No Transcript)
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Caroline Rizzi/Luciano
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Caroline Rizzi/Luciano
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Caroline Rizzi/Luciano
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Preparação do extrato bruto para purificação
Qual é a fonte de proteínas?
Qual é a escala de purificação?
Qual é o grau de pureza e atividade biológica
desejados?
Quais serão os procedimentos de purificação a
serem utilizados?
Questões?
Tecido, bactérias, intra ou extracelular?
Quais são os equipamentos disponíveis?
Luciano
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Preparação do extrato bruto para purificação
Condições básicas de obtenção
Realização rápida
Temperaturas baixas
Presença de tampão adequado e capaz de manter o
pH e de força iônica que estabilize a amostra
Amostras limpas e livres de partículas insolúveis.
Luciano
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Escolha do tampão

• Características do tampão
• Concentração quanto maior, maior tamponamento,
  mas não maior que 0,1M
• Tampões desejáveis
• 1. pKa do tampão deve ser próximo ao pH final da
  solução
• 2. O pH do tampão não pode ser afetado pelas
  pequenas variações de temperatura, diluições e
  adição de sais neutros
• 3. O tampão não deve ser reativo quimicamente
• 4. Não pode absorver luz a 280 nm
• 5.Tampões não podem interagir com componentes da
  mistura(exácido bórico e glicoproteínas).

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Escolha do tampão

• Goods buffers
• MES, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, HEPES, TAPS,
  CHES, CAPS quimicamente não reativos, não
  absorvem a 280 nm, o valor de pH não varia com
  temperatura e sais
• Muito mais caros
• Variações pequenas no pH (0,05 u) concentrações
  de 0,1 a 0,2 mM
• Variações bruscas no pH (gt 0,1 u) concentrações
  acima de 50 mM
• Reações enzimáticas cuidar a liberação ou
  captação de prótons.

• N. E. Good. G. D. Winget, W. Winter, T. N.
  Connolly, S. Izawa, and R. M. M. Singh,
  Biochernisrry5, 467 (1966)

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Caroline Rizzi
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Aditivos ao tampão

• NaCl
• EDTA
• Detergentes
• Inibidores de proteases
• Agentes redutores
• DNAse, RNAses
• Estabilizantes
• Conservantes.

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Aditivos ao tampão
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Preparação do extrato bruto
Eliminação da maior parte dos contaminantes e
substâncias insolúveis

• Centrifugação
• Remoção de ácidos nucléicos
• Precipitação de proteínas
• Diálise
• Filtração
• Concentração

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