Apopt

1
Apoptóza

• Prof. MUDr. Richard Pruša, CSc.
• ÚKBP, 2.LF UK a FN Motol
• Urceno pro studenty 2. LF

2
Apoptóza - definice

• Velmi komplexní dej zahrnující nekolik
  metabolických drah a velkou skupinu signálních
  transdukcních proteinu, které spolecne vedou k
  rízené programované bunecné smrti.
• SMRT bunky apoptóza aponekróza nekróza
• (nekróza nekontrolovaná bunecná smrt se
  zánetlivou reakcí)
• Klícem je IC obsah ATP, event. typ bunky

3
Predurcený zánik bunky

• Splnením dané úlohy
• Napr. behem embryogeneze, hormondependentní
  involuce (destrukce sliznice endometria v urcité
  fázi menstruacního cyklu, atrezie ovariálních
  folikulu v menopauze, regrese laktacní mlécné
  žlázy po skoncení kojení, zánik thymocytu)
• Excesívní a. Alzheimerova ch., Parkinsonova
  ch., diabetická retinopatie
• Insuficientní a. nádorové bujení

4
Metabolické dráhy programované smrti

• 1. Vnitrní, mitochondriální dráha (souboj pro- a
  anti- apoptotických proteinu) postupne tvorba
  komplexu cytochrom c/Apaf-1/kaspáza 9 APOPTOSOM
• 2. Vnejší, dráha membránového receptoru smrti
  (CD95 nebo TNF-R) postupne tvorba komplexu s
  kaspázou 8 a 10 a s FADD DISC
• Efektorové kaspázy 3, 6, 7 (rízená proteolýza)
• 3. Stresová dráha endoplasmatického retikula
  (kaspáza 12)

5
(No Transcript)
6
Spolecný most smrti

• Cysteinové proteázy (proteolýza)
• Kaspázy (cystein apsartyl-specific protease)
• Kalpainy (calcium-activated papain-like protease)
• Kathepsiny

7
Kalpainy (15)

• 14 genu pro velkou podjednotku, 2 geny pro malou
  podjednotku
• 8 splice variant pro kalpain 10 (10a-10h), 2
  splice varianty pro kalpain 2
• Typické heterodimer z katalytické a regulacní
  podjednotky, kalcium - nutné pro aktivaci
• Aktivní místo, cystein v pozici 115 (k.1), 105
  (k.2)

8
Kaspázy

• 12 lidských kaspáz (1-10, 12, 14)
• Aktivní kaspáza je homodimer, 2 aktivní místa
  (krome k.9) cystein v pozici 285, vysoká
  homologie, rozdíly v aktivním míste variabilita
  v substrátové specifite
• 1, 4, 5 tetrapeptid WEHD
• 2, 3, 7 tetrapeptid DEXD
• 6, 8, 9 tetrapeptid (L/V)EXD
• Iniciacní (domény CARD, DED) x efektorové kaspázy

9
(No Transcript)
10
Cílové molekuly kaspáz

• (strukturní proteiny, kinasy a reparace DNA)
• Keratin 18
• Lamin A, B
• Poly-ADP-ribosa-polymerasa (PARP)
• DNA-dependentní proteinkinasa
• U1-nukleoprotein
• Proteinkinasa C
• G-aktin, gelsolin, presenilin, fodrin

11
Regulace apoptózy

• Pro- apoptotické geny a proteiny
• Anti- apoptotické geny a proteiny
• Inhibitory apoptózy (IAP)
• Proteiny cytotoxických granul
• Antagonisté IAP

12
(No Transcript)
13
(No Transcript)
14
(No Transcript)
15
(No Transcript)
16
Pro- apoptotické proteiny

• BAK
• Bax
• Bcl-rambo
• Bcl-xs
• BOK/mtd
• BH3-only rodina Bcl-2 genu (Bad, BID, BIM, Bmf,
  BLK, Bik/Nbk, Noxa, PUMA (p53 upregulator of
  apopt.), Spike, BNIP3, Hrk/DP5)

17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
19
Anti- apoptotické proteiny

• A1
• Bcl-2
• Bcl-w
• Bcl-xES
• Bcl-xL
• Boo/DIVA
• Mcl-1
• NR-13

20
(No Transcript)
21
Inhibitory apoptózy cílem jsou kaspázy

• Apollon/BRUCE
• Survivin
• cIAP-1, cIAP-2 (cellular IAP)
• ILP-2
• XIAP (X-linked IAP)
• NAIP
• Livin/KIAP/ML-IAP
• NF-kB

22
(No Transcript)
23
Proteiny cytotoxických granul

• Kalretikulin
• Kathepsin B, C
• Fas ligand/TNFSF6
• Granulysin
• Perforin
• Serglycin
• Granzym A,B,C,D,E,F,G,H,K,M (serinové proteasy)
• Chemokiny(RANTES/CCL5, MIP-1a/CCL3 atd.)

24
(No Transcript)
25
Antagonisté IAP

• Smac/DIABLO
• (second mitochondria derived activator of a.)
• HtrA2/Omi

26
(No Transcript)
27
Laboratorní prukaz apoptózy

• Kaspázy- aktivita end point nebo žive v buecných
  kulturách (množství fluoro/chromo-foru
  uvolnených/min na mg CB)
• Promega, Merck Biosc., Sigma-Aldrich, Santa Cruz
  Biotech., RD Systems, Cambridge Biosc.
• Kaspázy - prutoková a laser-scanning cytometrie
• Kalpain aktivita
• Kalpain, kaspázy western blotting (produkty
  štepení)
• Imunohistochemická detekce kalpainu a kaspáz

28
Laboratorní prukaz apoptózy

• Non-cystein proteasové markery apoptózy
• Fosfatidylserin (flipázy) anexin V
• Fragmentace DNA ELISA, Laddering, TUNEL
  (3konce DNA fragmentu)
• Signální proteiny Fas, TNFR1, p53,
  proapoptotické Bcl-2 proteiny
• Mitochondriální markery cytochrom c v
  cytoplasme, m.membrán.potenciál, glutathion, GST
• (Nekróza propidium iodid, LDH)

29
Metabolické dráhy programované smrti

• 1. Vnitrní, mitochondriální dráha (souboj pro- a
  anti- apoptotických proteinu) postupne tvorba
  komplexu cytochrom c/Apaf-1/kaspáza 9 APOPTOSOM
• 2. Vnejší, dráha membránového receptoru smrti
  (CD95 nebo TNF-R) postupne tvorba komplexu s
  kaspázou 8 a 10 a s FADD DISC
• Efektorové kaspázy 3, 6, 7 (rízená proteolýza)
• 3. Stresová dráha endoplasmatického retikula
  (kaspáza 12)

30
Apoptóza

• Velmi komplexní dej zahrnující nekolik
  metabolických drah a velkou skupinu signálních
  transdukcních proteinu, které spolecne vedou k
  rízené programované bunecné smrti.
• SMRT bunky apoptóza aponekróza nekróza
• (nekróza nekontrolovaná bunecná smrt se
  zánetlivou reakcí)
• Klícem je IC obsah ATP, event. typ bunky