V4

1
V4 Analyse von Genomsequenzen
- Gene identifizieren z.B. Hidden Markov
Modelle - Transkriptionsfaktorbindestellen
identifizieren Position Specific Scoring
Matrices (PSSM) - finde Repeat-Sequenzen Suche
nach bekannten Repeat-Motiven -
Genom-Assemblierung finde identische k-Tupel -
Genom-Alignment Suche nach MUMs (maximal unique
matches)

2
Einleitung Gene identifizieren
Die einfachste Methode, DNA Sequenzen zu finden,
die für Proteine kodieren, ist nach open reading
frames (ORFs) zu suchen. In jeder Sequenz gibt es
6 mögliche open reading frames 3 ORFs starten
an den Positionen 1, 2, und 3 und gehen in die 5
3 Richtung, 3 ORFs starten an den Positionen 1,
2, und 3 und gehen in die 5 3 Richtung des
komplementären Strangs. In prokaryotischen
Genomen werden Protein-kodierende DNA-Sequenzen
gewöhnlich in mRNA transkribiert und die mRNA
wird ohne wesentliche Änderungen direkt in einen
Aminosäurestrang übersetzt. Daher ist der
längste ORF von dem ersten verfügbaren Met codon
(AUG) auf der mRNA bis zu dem nächsten Stopcodon
in demselben offenen Leserahmen, gewöhnlich eine
gute Vorhersage für die Protein-kodierende Region.
3
Methode
Erhalte neue genomische DNA-Sequenz
Übersetze sie in allen 6 Leserahmen und
vergleiche sie mit der Datenbank für
Protein- sequenzen. Führe Suche in
EST- Datenbank oder cDNA- Datenbank
desselben Organismus nach ähnlichen
Sequenzen durch, falls verfügbar.
Benutze Genvorhersage- programm um Gene zu finden
Analysiere regulatorische Sequenzen des Gens.
4
Extrinsische und intrinsische Methoden
Viele Verfahren kombinieren nun (a)
Homologie-Methoden extrinsische Methoden
mit (b) Genvorhersage-Methoden intrinsische
Methoden Etwa die Hälfte aller Gene kann durch
Homologie zu anderen bekannten Genen oder
Proteinen gefunden werden (dieser Anteil wächst
stetig, da die Anzahl an sequenzierten Genomen
und bekannten cDNA/EST Sequenzen kontinuierlich
wächst.) Um die übrige Hälfte an Genen zu
finden, muß man prädiktive Methoden einsetzen.

Mathé et al. Nucl. Acids. Res. 30, 4103 (2002)
5
Beispiel Vergleich von Glimmer und GeneMarksS

Besemer et al. Nucl. Acids. Res. 29, 2607 (2003)
6
Hidden Markov Models
Ein Hidden Markov Modell ist ein Graph, der
verschiedene Zustände verbindet. Jeder Zustand
kann möglicherweise eine Reihe an Beobachtungen
aussenden. Der Prozeß entwickelt sich in eine
Richtung, z.B. die Zeit. Man parametrisiert das
Modell mit Wahrscheinlichkeit für den Zustand zur
Zeit t 1, gesetzt dass die Zustände davor
bekannt sind.

7
TIGR GlimmerM, Exonomy and Unveil
Topologies of Unveil Exonomy 283-state
HMM 23-state GHMM

Majoros et al. Nucl. Acids. Res. 31, 3601 (2003)
8
Methoden funktionieren nicht überall
Ein Beispiel, in dem Exonomy die Gene richtig
erkennt. Ein Beispiel, in dem GlimmerM die
Gene richtig erkennt. Ein Beispiel, in dem
Unveil die Gene richtig erkennt (auch Genscan).

Majoros et al. Nucl. Acids. Res. 31, 3601 (2003)
9
Zusammenfassung
Die Resultate der Genvorhersage werden
zuverlässiger dennoch sollte man sie mit
Vorsicht behandeln. Sie sind sehr nützlich um
die Entdeckung von Genen zu beschleunigen. Dennoch
sind biologische Techniken notwendig um die
Existenz von virtuellen Proteinen zu bestätigen
und um dessen biologischen Funktion zu finden
bzw. zu beweisen. Dadurch werden vergleichende
Genom-Ansätze immer wichtiger, in denen Programme
Genkandidaten auf Homologie mit exprimierten
Sequenzen vergleichen (EST oder cDNA
Sequenzdaten). Neue Arbeiten wenden sich nun
RNA-kodierenden Genen zu.

Mathé et al. Nucl. Acids. Res. 30, 4103 (2002)
10
Transkriptions Gen-Regulationsnetzwerke
Die Maschine, die ein Gen transkribiert, besteht
aus etwa 50 Proteinen, einschließlich der RNA
polymerase, ein Enzym, das DNA code in RNA code
übersetzt. Eine Gruppe von Transkriptions-
faktoren bindet an die DNA gerade oberhalb der
Stelle des Kern-Promoters, während assoziierte
Aktivatoren an Enhancer-Regionen weiter oberhalb
der Stelle binden.

a
http//www.berkeley.edu/news/features/1999/12/09_n
ogales.html
11
Promoter prediction in E.coli

• To analyze E.coli promoters, one may align a set
  of promoter sequences by the position that marks
  the known transcription start site (TSS) and
  search for conserved regions in the sequences.
• E.coli promoters are found to contain 3
  conserved sequence features
• a region approximately 6 bp long with consensus
  TATAAT at position -10
• a region approximately 6 bp long with consensus
  TTGACA at position -35
• a distance between these 2 regions of ca. 17 bp
  that is relatively constant

a
12
Feasibility of computational motif search?

• Computational identification of transcription
  factor binding sites is difficult because they
  consist of short, degenerate sequences that occur
  frequently by chance.
• The problem is not easy to define (therefore it
  is complex) because
• - the motif is of unknown size
• - the motif might not be well conserved between
  promoters
• - the sequences used to search for the motif do
  not necessarily represent the complete promoter
• - genes with promoters to be analyzed are in many
  cases grouped together by a clustering algorithm
  which has its own limitations.

13
Strategy 1
Arrival of microarray gene-expression
data. Group of genes with similar expression
profile (e.g. those that are activated at the
same time in the cell cycle) ? one may assume
that this profile ist, at least partly, caused by
and reflected in a similar structure of the
regions involved in transcription
regulation. Search for common motifs in lt 1000
base upstream regions. Sofar used detection of
single motifs (representing transcription-factor
binding sites) common to the promoter sequences
of putatively co-regulated genes. Better search
for simultaneous occurrence of 2 or more sites at
a given distance interval! Search becomes more
sensitive.

14
Motif-Identifizierung
A flowchart to illustrate the two different
approaches for motif identification. We analyzed
800 bp upstream from the translation start sites
of the five genes from the yeast gene family PHO
by the publicly available systems MEME
(alignment) and RSA (exhaustive search). MEME was
run on both strands, one occurrence per sequence
mode, and found the known motif ranked as second
best. RSA Tools was run with oligo size 6 and
noncoding regions as background, as set by the
demo mode of the system. The well-conserved
heptamer of the motifs used by MEME to build the
weight matrix is printed in bold.

Ohler, Niemann Trends Gen 17, 2 (2001)
15
Strategie 2 Erschöpfende Motivsuche in
upstream-Regionen

• Benutze Beobachtung daß relevante Motive sich in
  der upstream-Region oft viele Mal wiederholen,
  unter Umständen mit kleinen Variationen, damit
  die regulatorische Wirkung effektiv ist.
• Suche in der upstream-Region nach
  überrepräsentierten Motiven
• Ordne Gene nach den überrepräsentierten Motiven.
• Analysiere Gruppen von Genen, die Motive für
  Ko-Regulation in Microarray-Experimenten
  gemeinsam haben.
• Betrachte überrepräsentierte Motive, die Gruppen
  von koregulierten Genen als mögliche
  Bindungsstellen markieren.

Cora et al. BMC Bioinformatics 5, 57 (2004)
16
Erschöpfende Motivsuche in upstream-Regionen
Exploit

Cora et al. BMC Bioinformatics 5, 57 (2004)
17
Aktuelle Verfahren um Promotoren zu finden

Ohler, Niemann Trends Gen 17, 2 (2001)
18
Positions-spezifische Gewichtsmatrix
Populäres Verfahren wenn es eine Liste von Genen
gibt, die ein TF-Bindungs-motiv gemeinsam haben.
Gute MSAs müssen vorhanden sein. Alignment-Matrix
wie häufig treten die verschiedenen Buchstaben
an jeder Position im Alignment auf?

Hertz, Stormo (1999) Bioinformatics 15, 563
19
Positions-spezifische Gewichtsmatrix
Beispiele für Matrizen, die von YRSA verwendet
werden

http//forkhead.cgb.ki.se/YRSA/matrixlist.html
20
3D Strukturen von Transkriptionsfaktoren

1AU7.pdb
1A02.pdb
1AM9.pdb
TFs binden auf sehr unterschiedliche
Weise. Manche sind sehr selektiv für die
DNA-Konformation.
2 TFs bound!
1CIT.pdb
1GD2.pdb
1H88.pdb
http//www.rcsb.org
21
Datenbank für eukaryotische Transkriptionsfaktoren
TRANSFAC
BIOBase / TU Braunschweig / GBF Relationelle
Datenbank 6 Dateien FACTOR Wechselwirkung von
TFs SITE ihre DNA-Bindungsstelle GENE durch
welche sie diese Zielgene regulieren CELL wo
kommt Faktor in Zelle vor? MATRIX TF
Nukleotid-Gewichtungsmatrix CLASS
Klassifizierungsschema der TFs

Wingender et al. (1998) J Mol Biol 284,241
22
Datenbank für eukaryotische Transkriptionsfaktoren
TRANSFAC
BIOBase / TU Braunschweig / GBF

Matys et al. (2003) Nucl Acid Res 31,374
23
Datenbank für eukaryotische Transkriptionsfaktoren
TRANSFAC
BIOBase / TU Braunschweig / GBF

Matys et al. (2003) Nucl Acid Res 31,374
24
TRANSFAC Klassifizierung
1 Superklasse basische Domänen 3 Superklasse
Helix-turn-helix 1.1 Leuzin-zipper Faktoren
(bZIP) 1.2 Helix-Loop-Helix Faktoren (bHLH) 4
Superklasse beta-Scaffold 1.3 bHLH-bZIP
Faktoren mit Kontakt in der 1.4
NF-1 Minor Groove 1.5 RF-X 1.6 bHSH 5
Superklasse andere 2 Superklasse
Zink-koordinierende DNA-bindende Domänen 2.1 Cys4
Zinkfinger vom Typ nuklearer Rezeptor 2.2
verschiedene Cys4 Zinkfinger 2.3 Cys2His2
Zinkfinger Domänen 2.4 Cys6 Cystein-Zink
Cluster 2.5 Zinkfinger mit abwechselnder
Zusammensetzung

http//www.gene-regulation.com/pub/databases/trans
fac/cl.html
25
TRANSFAC Datenbank
Eintrag für 1.1 Leuzine-Zippers

http//www.gene-regulation.com
26
TRANSFAC Datenbank

http//www.gene-regulation.com
27
TRANSFAC Datenbank

http//www.gene-regulation.com
28
Zusammenfassung
Es gibt große Datenbanken (z.B. TRANSFAC) mit
Informationen über Promoterstellen. Diese
Informationen sind experimentell
überprüft. Microarray-Daten erlauben es, nach
gemeinsamen Motiven von ko-regulierten Genen zu
suchen. Auch möglich gemeinsame Annotation in
der Gene Ontology etc. TF-Bindungsmotive sind
oft überrepräsentiert in der 1000 bp-Region
upstream. Die klare Funktion davon ist
unbekannt. Relativ wenige TFs regulieren eine
große Anzahl an Genen.

http//www.gene-regulation.com
29
Identifizierung von Repeats RepeatMasker
RepeatMasker durchsucht DNA Sequenzen auf -
eingefügte Abschnitte, die bekannten
Repeat-Motiven entsprechen (dazu wird eine lange
Tabelle mit bekannten Motiven verwendet) und -
auf Regionen geringer Komplexität (z.B. lange
Abschnitt AAAAAAAA). Output - detaillierte
Liste, wo die Repeats in der Sequenz auftauchen
und - eine modifizierte Version der
Input-Sequenz, in der die Repeats maskiert
sind, z.B. durch Ns ersetzt sind. Für die
Sequenzvergleiche wird eine effiziente
Implementation des Smith-Waterman-Gotoh
Algorithmus verwendet.

http//www.gene-regulation.com
30
Whole Genome Shotgun Assemblierung
Es gibt 2 Strategien für die Sequenzierung von
Genomen clone-by-clone Methode whole-genome
shotgun Methode (Celera, Gene Myers). Die
Shotgun Sequenzierung wurde bereits 1977 von F.
Sanger et al. eingeführt und ist seither eine
Standardmethode für die Sequenzierung von
Genen. Umstritten war jedoch, ob man sie auch
für komplette Genome verwenden kann.

ED Green, Nat Rev Genet 2, 573 (2001)
31
Arachne Programm

• von Serafin Batzoglou (MIT, Doktorarbeit 2000)
• konstruiere Graph G für Überlappungen zwischen
  Paaren von reads aus
• Shotgun-Daten
• prozessiere G um Supercontigs von gemappten reads
  zu erhalten.

Wichtige Variation der whole-genome shotgun
Sequenzierung sequenziere reads jeweils von
beiden Enden eines Klons. Da die Inserts nach
ihrer Größe ausgewählt werden, ist damit der
ungefähre Abstand zwischen dem Paar von reads
bekannt. Man nennt diese earmuff (Ohrenwärmer)
Verbindungen.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
32
Arachne erzeuge Überlappungsgraphen
Liste von reads R (r1, ..., rN) , N ist die
Anzahl der reads. Jeder read ri besitzt eine
Länge li lt 1000. Wenn beide reads von den
Endpunkten desselben Klons stammen (earmuff
link), besitzt ri eine Verknüpfung zu einem
anderen read rj in einer festen Distanz dij.
Erstes Ziel erzeuge Graphen G der
Überlappungen (Kanten) zwischen Paaren an reads
(Knoten) ? dies ergibt die Paare an reads in R,
die aligniert werden müssen. Da R sehr lang
sein kann, sind N2 alignments nicht
praktikabel. ? erstelle Tabelle für das
Vorkommen von k-Tupel (Strings der Länge k) in
den reads, zähle die Anzahl von k-Tupel Treffern
für jedes Paar an reads. Führe dann paarweise
Alignments zwischen den Paaren an reads
durch, die mehr als cutoff gemeinsame k-mere
besitzen.

Batzoglou PhD thesis (2002)
33
Arachne Tabelle für Vorkommen von k-meren
Ermittle die Anzahl an k-Tupel Treffern in der
Vorwärts- und Rückwärts-Richtung zwischen jedem
Paar von reads in R. (1) Ermittle alle Triplets
(r,t,v) r Nummer des reads in R t Index
eines k-mers, das in r vorkommt v Richtung des
Auftretens (vorwärts oder rückwärts) (2)
sortiere die Menge der Paare nach den k-mer
Indices t (3) verwende eine sortierte Liste um
eine Tabelle T von Quadrubletts (ri, rj, f, v)
zu erstellen, wobei ri und ri die reads sind,
die mindestens einen gemeinsamen k-mer enthalten,
v die Richtung angiebt, und f die Anzahl an
gemeinsamen k-mers zwischen ri und rj in Richtung
v.

Batzoglou PhD thesis (2002)
34
Arachne Tabelle für Vorkommen von k-mers

Hier k 3
Batzoglou PhD thesis (2002)
35
Arachne Tabelle für Vorkommen von k-mers

• Wenn ein k-Tupel zu oft auftritt ? gehört er
  wahrscheinlich zu einer
• Repeat-Sequenz.
• Man sollte diese nicht für die Detektion von
  Überlappungen verwenden.
• Implementierung
• finde k-Tupel (r,t,v) und sortieren sie in 64
  Dateien entsprechen den ersten
• drei Nukleotiden jedes k-mers.
• Für i1,64
• lade Datei in den Speicher, sortiere nach t,
  speichere sortierte Datei ab.
• end
• lade 64 sortierte Dateien nacheinander in den
  Speicher,
• fülle Tabelle T nacheinander auf.
• In der Praxis ist k 8 bis 24.

Batzoglou PhD thesis (2002)
36
Arachne paarweise read-Alignments
Führe paarweise Alignments zwischen den Reads
durch, die mehr als Cutoff gemeinsame k-mers
besitzen. Sobald man zu häufige k-mers
ausschließt (mehr als ein zweiter Cutoff), ist
sichergestellt, daß nur O(N) viele paarweise
Sequenzalignments durchgeführt werden
müssen. Nur eine kleine Anzahl an
Basen-Austauschen und Indels ist in einer
überlappenden Region zweier alignierter reads
erlaubt. Output des Alignment-Algorithmus für
die reads ri, rj gibt es Quadrubletts (b1, b2,
e1, e2) für jede detektierte Überlappungsregion
mit den Anfangspositionen b1, b2 und
Endpositionen e1,e2. Falls eine signifikante
Überlappungsregion vorliegt, wird (ri, rj, b1,
b2, e1, e2) eine Kante im Überlappungsgraphen G.

Batzoglou PhD thesis (2002)
37
Kombination teilweiser Alignments
3 teilweise Alignments der Länge k6 zwischen
einem Paar von reads werden zu einem einzigen
vollen Alignment der Länge k19 kombiniert. Die
vertikalen Linien verbinden übereinstimmenden
Basen, wogegen x Mismatche sind. Dies ist eine
oft auftretende Situation, in der ein
ausgedehnter k-mer Treffer ein volles Alignment
von zwei reads ist.

Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
38
Repeats erzeugen Mehrdeutigkeit
Ohne das Auftreten von Sequen-zierungsfehlern und
Repeats wäre es einfach, alle entdeckbaren
paarweise Abstände von reads zu finden und den
Graph G zu konstruieren. Da es Repeats jedoch
sehr häufig auftreten, bedeutet eine Verbindung
zwischen zwei reads in G nicht ohne weiteres eine
wahre Überlappung. Eine Repeat-Verbindung ist
eine Verbindung in G zwischen zwei reads, die aus
verschiedenen Regionen des Genoms stammen und in
der repetitiven Sequenz überein-stimmen.

Batzoglou PhD thesis (2002)
39
Sequence contigs
unerläßlich für die Assemblierung ist die
ausreichende Überdeckung (mehrfache Sequenzierung
coverage) derselben Genomregionen

Batzoglou PhD thesis (2002)
40
Verbinden von Contigs
Durch die Löschung von k-mers hoher Frequenz wird
einiges an Repetition im Genom vor der Erzeugung
von G effizient maskiert. Zur Erkennung von
repetitiven Verbindung dienen weitere
heuristische Algorithmen, die hier nicht
diskutiert werden sollen.

Sequenz-Contigs werden gebildet indem Paare von
reads verbunden werden, die eindeutig
verbunden werden können. Tatsächlich ist die
Situation viel schwieriger als hier gezeigt,
da Repeats häufig nicht zu 100 zwischen Kopien
konserviert sind.
Batzoglou PhD thesis (2002)
41
Benutze Überlapp-Paarungen um die reads zu
verbinden

• Arachne sucht nach 2 Plasmiden mit gleicher
  Insert-Länge, deren Sequenzen an beiden Enden
  überlappen ? paired pairs.

(A) A paired pair of overlaps. The top two reads
are end sequences from one insert, and the bottom
two reads are end sequences from another. The
two overlaps must not imply too large a
discrepancy between the insert lengths. (B)
Initially, the top two pairs of reads are merged.
Then the third pair of reads is merged in, based
on having an overlap with one of the top two
left reads, an overlap with one of the top two
right reads, and consistent insert lengths. The
bottom pair is similarly merged.
Unten eine Menge von paired pairs werden zu
contigs zusammengefasst und eine Konsensussequenz
erzeugt.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
42
Detection of repeat contigs
Some of the identified contigs are repeat contigs
in which nearly identical sequence from distinct
regions are collapsed together. Detection by (a)
repeat contigs usually have an unusually high
depth of coverage. (b) they will typically have
conflicting links to other contigs.

Contig R is linked to contigs A and B to the
right. The distances estimated between R and A
and R and B are such A and B cannot be positioned
without substantial overlap between them. If
there is no corresponding detected
overlap between A and B then R is probably a
repeat linking to two unique regions to the
right.
After marking repeat contigs, the
remaining contigs should represent the
correctly assembled sequence.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
43
Contig assembly
If (a,b) and (a,c) overlap, then (b,c) are
expected to overlap. Moreover, one can calculate
that shift(b,c)shift(a,c)-shift(a,b). A repeat
boundary is detected toward the right of read a,
if there is no overlap (b,c), nor any path of
reads x1, ..., xk such that (b,x1), (x1,x2) ...,
(xk,c) are all overlaps, and shift(b,x1) ...
shift(xk,c) ? shift(a,c) shift(a,b).

Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
44
Consistency of forward-reverse links

1. The distance d(A,B) (length of gap or negated
   length of overlap) between two linked contigs A
   and B can be estimated using the forward-reverse
   linked reads between them.
2. The distance d(B,C) between two contigs B,C that
   are linked to the same contig A can be estimated
   from their respective distances to the linked
   contig.

Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
45
Contig Coverage and Read Usage

Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
46
Characterization of Contigs and Supercontigs

Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
47
Base Pair Accuracy

base quality x10 means that (on average) one
sequencing error occurs in 10-x bases.
Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
48
Computational Performance

Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)
49
Vergleich verschiedener Assemblierungen

• man sollte gucken nach
• - welche Methode gibt die kleinste Anzahl an
  Contigs bzw. die kleinesten Anzahl am festen
  Contigs bzw. falsch assemblierten Contigs
• die größt mögliche Abdeckung durch Contigs
• falsch assemblierte Contigs sollten einen
  möglichst geringen Teil des Genoms ausmachen.

Pevzner, Tang, Waterman PNAS 98, 9748 (2001)
50
There is no error-free assembler to date
Comparative analysis of EULER, PHRAP, CAP, and
TIGR assemblers (NM sequencing project). Every
box corresponds to a contig in NM assembly
produced by these programs with colored boxes
corresponding to assembly errors. Boxes in the
IDEAL assembly correspond to islands in the read
coverage. Boxes of the same color show
misassembled contigs. Repeats with similarity
higher than 95 are indicated by numbered boxes
at the solid line showing the genome. To check
the accuracy of the assembled contigs, we fit
each assembled contig into the genomic sequence.
Inability to fit a contig into the genomic
sequence indicates that the contig is
misassembled. For example, PHRAP misassembles
17 contigs in the NM sequencing project, each
contig containing from two to four fragments from
different parts of the genome.

Biologists "pay" for these errors at the
time-consuming finishing step.
Pevzner, Tang, Waterman PNAS 98, 9748 (2001)
51
Whole Genome Alignment (WGA)
Nachdem die genomische DNA-Sequenz eng verwandter
Organismen verfügbar wird, ist die erste Frage,
wie das Alignment zweier Genome
aussieht. Globale Genom-Alignments machen nur
für eng verwandte Organismen Sinn. Im anderen
Fall muß man erst die genomischen Rearrangements
betrachten. Dann kann man die systenischen
Regionen (Regionen, in denen Gen-Reihenfolge des
nächsten gemeinsamen Vorfahrens in beiden Spezies
konserviert blieb) betrachten und lokale
Genom-Alignments dieser Regionen produzieren.
52
Konservierung von Syntenie zwischen Mensch und
Maus

Ein typisches 510-kb Segment des Maus-Chromosoms
12, das mit einem 600-kb Stück des menschlichen
Chromosom 14 verwandt ist. Blaue Linien reziprok
eindeutige Treffer in beiden Genomen. Rote
Markierungen kennzeichnen die Länge der passenden
Regionen. Die Abstände zwischen diesen
Landmarks sind im Maus-Genom kleiner als im
Mensch, was mit der 14 kürzeren Gesamtlänge des
Genoms übereinstimmt.
The mouse genome. Nature 420, 520 - 562
53
Entsprechung syntenischer Regionen

342 Segmente und 217 Blöcke gt300 kb mit
konservierter Syntenie im Mensch sind im
Maus-Genom markiert. Jede Farbe entspricht
einem bestimmten menschlichen Chromosom.
The mouse genome. Nature 420, 520 - 562
54
Sensitivität
Im globalen MenschMaus Alignment sind mehr als
eine Millionen Regionen stärker als 70
konserviert (auf 100-bp Level) diese Regionen
decken gt 200 Million bp ab. Nur 62 von ihnen
werden von (lokalen) BLAT-Treffern
abgedeckt. Dies bedeutet, daß man 38 der
konservierten Abschnitte nur durch das globale
Alignment finden kann! Idee lokales Alignment
soll als Anker-Verfahren für anschliessendes
globales Alignment dienen. Dadurch hofft man,
viele zusätzliche konservierte Regionen
ausserhalb der Anker-Regionen zu finden.
Couronne, ..., Dubchak, Genome Res. 13, 73 (2003)
55
hohe Sensitivität von globalen Alignments
Beispiel das globale Alignment der mouse
finished sequence NT_002570 gegen die Region, die
mit BLAT-Ankern gefunden wurde, zeigt
konservierte kodierende und nicht-kodierende
Elemente, die mit BLAT nicht gefunden wurden.
Couronne, ..., Dubchak, Genome Res. 13, 73 (2003)
56
Ankerbasierte Methoden für WGA
Diese Methoden versuchen sich entsprechende Teile
der Buchstabenfolgen der betrachteten Sequenzen
zu finden, die wahrscheinlich zu einem globalen
Alignment gehören werden. (Diese teilweisen
Treffer können durch lokale Alignments gefunden
werden). Sie bilden Anker in den beiden zu
alignierenden Sequenzen. In diesen Methoden
werden zuerst die Ankerpunkte aligniert und dann
die Lücken dazwischen geschlossen. MUMmer ist
eine sehr erfolgreiche Implementation dieser
Strategie für das Alignment zweier genomischer
Sequenzen.
57
Was ist MUMmer?

• A.L. Delcher et al. 1999, 2002 Nucleic Acids Res.
  
• http//www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/webmum/mumpl
  ot
• Nimm an, dass zwei Sequenzen eng verwandt sind
  (sehr ähnlich)
• MUMmer kann zwei bakterielle Genome in weniger
  als 1 Minute alignieren
• nutzt Suffix-Bäume um Maximal Unique Matches zu
  finden
• Definition eines Maximal Unique Matches (MUM)
• Eine Subsequenz, die in beiden Sequenzen genau
  einmal ohne Abweichungen vorkommt und in keine
  Richtung verlängert werden kann.
• Grundidee ein MUM ausreichender Länge wird
  sicher Teil eines globalen Alignments sein.

A maximal unique matching subsequence (MUM) of 39
nt (shown in uppercase) shared by Genome A and
Genome B. Any extension of the MUM will result in
a mismatch. By definition, an MUM does not occur
anywhere else in either genome.
Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)
58
MUMmer wichtige Schritte

• Erkenne MUMs (Länge wird vom Benutzer festgelegt)

ACTGATTACGTGAACTGGATCCA ACTCTAGGTGAAGTGATCCA
ACTGATTACGTGAACTGGATCCA ACTCTAGGTGAAGTGATCCA
10
1
20
ACTGATTACGTGAACTGGATCCA ACTC--TAGGTGAAGTG-ATCCA
1
10
20
59
Definition von MUMmers

• Für zwei Strings S1 und S2 und einen Parameter l
• Der Substring u ist eine MUM Sequenz wenn gilt
• u gt l
• u kommt genau einmal in S1 und genau einmal in S2
  (Eindeutigkeit)
• Für jeden Buchstaben a kommt weder ua noch au
  sowohl in
• S1 als auch in S2 vor (Maximalität)

60
Wie findet man MUMs?

• Naiver Ansatz
• Vergleiche alle Teilsequenzen von A mit allen
  Teilsequenzen von B.
• Dies dauert O(nn)
• verwende Suffix-Bäume als Datenstruktur
• ein naiver Ansatz, einen Suffix-Baum zu
  konstruieren hat
• eine quadratische Komplexität in der Rechenzeit
  und dem Speicherplatz
• durch klevere Benutzung von Pointern gibt es
  lineare Algorithmen in Rechenzeit und
  Speicherplatz wie den Algorithmus von McCreight

61
Suffix-Bäume

• Suffix-Bäume sind seit über 20 Jahren wohl
  etabliert.
• Einige ihrer Eigenschaften
• ein Suffix beginnt an jeder Position I der
  Sequenz und reicht bis zu ihrem Ende.
• Eine Sequenz der Länge N hat N Suffices.
• Es gibt N Blätter.
• Jeder interne Knoten hat mindest zwei Kinder.
• 2 Kanten aus dem selben Knoten können nicht mit
  dem selben Buchstaben beginnen.
• Am Ende wird angefügt

CACATAG
62
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG
C
Suffixes 1. CACATAG
A
C
A
T
A
G

1
63
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG
A
Suffixes 1. CACATAG 2. ACATAG
C
A
C
C
A
A
T
T
A
A
G
G


2
1
64
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG
A
Suffixes 1. CACATAG 2. ACATAG 3. CATAG
C
A
C
C
A
A
T
T
T
A
A
A
G
G
G



2
3
1
65
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG
A
Suffixes 1. CACATAG 2. ACATAG 3. CATAG 4.
ATAG
C
T
G

A
4
A
C
C
A
A
T
T
T
A
A
A
G
G
G



2
3
1
66
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG
A
Suffixes 1. CACATAG 2. ACATAG 3. CATAG 4.
ATAG 5. TAG
C
T
G

A
4
A
C
C
A
T
A
T
T
A
T
A
A
G
A
G
G
G




2
3
1
5
67
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG
A
C
Suffixes 1. CACATAG 2. ACATAG 3. CATAG 4.
ATAG 5. TAG 6. AG
T
G

A
4
A
C
C
A
T
A
T
G
T
A
T

A
A
G
A
6
G
G
G




2
3
1
5
68
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG
G

7
A
C
Suffixes 1. CACATAG 2. ACATAG 3. CATAG 4.
ATAG 5. TAG 6. AG 7. G
T
G

A
4
A
C
C
A
T
A
T
G
T
A
T

A
A
G
A
6
G
G
G




2
3
1
5
69
Konstruktion eines Suffix-Baums
CACATAG
G


7
8
A
C
Suffixes 1. CACATAG 2. ACATAG 3. CATAG 4.
ATAG 5. TAG 6. AG 7. G 8.
T
G

A
4
A
C
C
A
T
A
T
G
T
A
T

A
A
G
A
6
G
G
G




2
3
1
5
70
Suchen in einem Suffix-Baum
G


Search Pattern CATA
7
8
A
C
T
G

A
4
A
C
C
A
T
A
T
G
T
A
T

A
A
G
A
6
G
G
G




2
3
1
5
71
Suchen in einem Suffix-Baum
G


Search Pattern ATCG
7
8
A
C
T
G

A
4
A
C
C
A
T
A
T
G
T
A
T

A
A
G
A
6
G
G
G




2
3
1
5
72
Sortieren der MUMs

• MUMs werden nach ihren Positionen in Genom A
  sortiert

Genome A
1
2
3
4
5
6
7
Genome B
3
6
5
1
2
4
7
Genome A
1
2
4
6
7
Genome B
6
7
2
1
4
Jeder MUM ist nur mit seiner Nummer
gekennzeichnet, ohne Berücksichtigung seiner
Länge. Das obere Alignment zeigt alle MUMs. Die
Verschiebung von MUM 5 in Genom B zeigt eine
Transposition an. Die Verschiebung von MUM 3
könnte ein Zufallstreffer oder Teil einer
inexakten Repeat-Sequenz sein. Unteres
Alignment suche in beiden Genomen die längste
gemeinsam ansteigende Folge an Subsequenzen
73
Beispiel Alignment zweier Mikroorganismen
Das Genom von M.genitalium ist nur etwa 2/3 so
lang wie das von M.pneumoniae. Obere Abbildung
FASTA-Alignment von M.genitalium und
M.pneumoniae. Mitte Alignment mit 25mers
Unten Alignment mit MUMs. 5 Translokationen. E
in Punkt bedeutet jeweils einen Treffer zwischen
den Genomen. FASTA-Plot ähnliche
Gene 25-mer-Plot 25-Basen-Sequenz, die in beiden
Sequenzen genau einmal vorkommt. MUM-Plot
MUM-Treffer.
Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)
74
Beispiel Alignment MenschMaus
Alignment von weiter entfernt liegenden
Spezies Mensch gegen Maus. Hier Alignment
einer 222 930 bp Teilsequenz auf dem
mensch-lichen Chromosom 12, accession no. U47924,
gegen eine 227 538 bp lange Teilsequenz des
Maus-chromosoms 6. Jeder Punkt des Plots
entspricht einem MUM von ge15 bp.
Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)
75
Zusammenfassung

• Die Anwendung der Suffix-Bäume war ein Durchbruch
  für die Alignierung ganzer Genome
• MUMmer 2 besitzt zusätzliche Verbesserung für die
  Rechenzeit und den Speicherplatz
• die Verwendung von Suffix-Arrays anstatt von
  Suffix-Bäumen gibt eine verbesserte Datenstruktur
  (? Stefan Kurtz, Hamburg)
• es wird nun möglich, mehr als zwei Genome zu
  alignieren (implementiert in MGA)