Diapositiva 1

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Facoltà di Farmacia LEZIONI DI BIOLOGIA ANIMALE
E MICROBIOLOGIA VIROLOGIA AA 2006 2007
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Generalità sui virus

• I virus sono agenti patogeni entità acellulari
  formati da una o più molecole di DNA o RNA
  racchiuse in un involucro proteico in grado di
  infettare cellule animali e vegetali e batteri.
• Le particelle virali complete sono
  contraddistinte da dimensioni molto modeste (da
  10 a 300 nm).
• Si possono replicare allinterno di cellule
  viventi e quindi sono dei parassiti
  intracellulari obbligati
• La morfologia dei i virus può essere studiata
  attraverso luso del microscopio elettronico
• La replicazione dei virus avviene nellorganismo
  di animali suscettibili allinfezione, e
  sperimentalmente, per inoculazione in animali da
  laboratorio in uova embrionate di pollo o in
  colture cellulari
• I costituenti essenziali sono ac. nucleici e
  proteine.

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In tutti i virus è presente un nucleocapside
costituito da un ac. Nucleico avvolto da un
capside proteico con struttura elicoidale,
complessa, icosaedrica.
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Terminologia

• core ac. nucleico molecola di natura
  proteica che determina la stabilità dellacido.
• capside struttura proteica che racchiude lac.
  nucleico o il core.
• capsomero unità proteica che ripetuta forma il
  capside non sono legati da legami covalenti.
• nucleocapside ac. nucleico capside.
• envelope involucro lipoglicoproteico esterno
  (ortho- e paramyxo- virus)
• peplomeri (neuroamminidasi ed emoagglutinina)
  proiezioni superficiali che protrudono
  dallenvelope. le emoagglutinine sono strutture a
  bastoncino con attività emoagglutinante mentre le
  neuroamminidasi hanno attività enzimatica.
• virione particella virale completa come si può
  osservare fuori dalla cellula.

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• I genomi virali sono più differenziati ed
  eterogenei di quelli procariotici ed eucariotici
  e possono consistere in uno o due filamenti di
  DNA o RNA, i filamenti di ac. Nucleico sono
  lineari, circolari o tali da assumere entrambe le
  forme.
• I virus sono classificati in base alle
  caratteristiche degli ac. Nucleici alla simmetria
  del capside, alleventuale presenza di un
  involucro, al tipo di ospite infettato, alle
  patologie provocate, in caso di virus animali e
  vegetali.

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Composizione chimica

• Acidi nucleici e proteine sono i componenti
  principali della struttura virale.
• La tecnica che permette la purificazione dei
  virus è la ultracentrifugazione in gradiente di
  densità, questa tecnica permette la separazione
  di particelle fagiche che sono differenti anche
  per percentuali dell 1 di DNA.
• Le proteine virali possono essere suddivise in
  tre classi proteine che permettono all Acido
  Nucleico di replicarsi, proteine strutturali, che
  sono costituenti del capside o sono
  emoagglutinine, proteine che alterano alcune
  funzioni e strutture della cellula ospite,
  bloccano ad esempio la trascrizione del DNA
  cellulare e lasciando così i ribosomi a
  disposizione dell RNA virale.

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Replicazione e caratteristiche virali

• Il capside è formato da subunità proteiche che in
  alcuni virus si aggregano a formare i capsomeri,
  con peso molecolare tra 10 e 80 KDA (1 Dalton
  1/6 della massa atomica dellossigeno 1,66x10-24g
  ).
• Non sempre tutte le proteine che si trovano nel
  virus entrano nella formazione del capside a
  volte esse sono devolute a funzioni di
  stabilizzazione dellacido nucleico si tratta
  delle cosiddette proteine interne in stretta
  relazione con lacido nucleico.
• I virus posseggono una molecola di DNA il cui
  peso molecolare è 1,5 a 240 x 106 daltons
  (poxvirus), di solito si tratta di un doppio
  filamento in genere lineare.
• Per lRNA virale quasi sempre si tratta di un
  filamento a catena singola con peso molecolare da
  2,4 a 10-12 x 106 daltons. Non sempre è presente
  in un unica molecola ma viene spesso estratto in
  frammenti.
• Nei virioni sono presenti altri costituenti che
  contengono elevate quantità di lipidi. Questi
  lipidi sono identici a quelli della cellula dove
  il virus si è replicato.
• La quantità di materiale genetico presente è in
  diretta relazione con il grado di complessità
  della particella virale.
• In alcune specie sono presenti rame, biotina, Fad
  (ruolo funzionale sconosciuto).

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COSTRUZIONE VIRALE
La struttura virale è formata da subunità uguali
che vengono ripetute (nei virus a forma
icosaedrica) infatti è più efficiente costruire
strutture complesse e più grandi a partire da
subunità tutte uguali e più piccole.

• vengono codificati solo pochi peptidi o anche uno
  solo.
• non viene richiesta informazione supplementare
  per lassemblaggio delle subunità virali.
• un meccanismo di rigetto è attivo per le subunità
  non funzionanti.

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(No Transcript)
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CRONOLOGIA DELLE SCOPERTE IN VIROLOGIA

• 1888-1892
• studi sullafta epizootica e sul mosaico del
  tabacco (Ivanovsky e Beijerink) dimostrano che
  queste malattie erano causate da subunità
  microscopiche che non potevano essere osservate e
  coltivate come batteri e funghi.
• Risolutivo fu lo studio sul mosaico del tabacco,
  si dimostrò che esistevano subunità microscopiche
  che attraversavano i filtri per batteriologia è
  quindi presenti in una soluzione capce di
  infettare un0altra pianta di tabacco.
• 1911
• ROUS SCOPRE IL VIRUS DEL TUMORE DEI POLLI.
• 1915
• SCOPERTA DEI BATTERIOFAGI E RAPPORTI TRA CELLULA
  OSPITE E BATTERIOFAGO.
• 1920
• COLTURE CELLULARI VIVENTI IMPIEGATE NELLO STUDIO
  DELLE INFEZIONI VIRALI DELLUOMO.
• 1939
• IMPIEGO DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA.
• 1952
• AC. NUCLEICI E INFEZIONE VIRALE(HERSHEY E CHASE).
• 1970
• DIMOSTRAZIONE DELLESISTENZA DI UN ENZIMA VIRALE
  CHE IMPIEGA STAMPI DI RNA PER SINTETIZZARE DNA,
  LA TRASCRITTASI INVERSA.
• NEGLI ULTIMI 30 ANNI MESSA A PUNTO DI VACCINI
  ANTIVIRALI E IMPIEGO DEI VIRUS NELLE
  BIOTECNOLOGIE E NELLA CURA DELLE MALATTIE.

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Interazione del virus con la cellula ospite

• Adsorbimento interazione tra strutture
  superficiali del virione e le strutture della
  cellula.
• Penetrazione (periodo di eclissi) e svestimento.
• Replicazione (diversi tipi di replicazione).
• Maturazione (aggregazione spontanea del materiale
  genetico con le componenti).
• Liberazione (periodo di latenza)

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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GEMMAZIONE
PROTEINE DELLA MATRICE E PEPLOMERI
GEMMAZIONE ATTRAVERSO APPARATO DEL GOLGI E IL RER
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ADSORBIMENTO E PENETRAZIONE
Il meccanismo di adsorbimento è interamente
devoluto al riconoscimento di siti specifici, da
parte delle fibre che si distendono ed ancorano
il fago al batterio, in un secondo momento gli
aculei portano a contatto la piastra basale con
la parete batterica, la guaina si contrae e
forza la coda a penetrare, lazione della coda è
facilitata dalla presenza di un enzima (lisozima)
infine il DNA fagico penetra attraverso il
canale.
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(No Transcript)
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Rappresentazione schematica del ciclo replicativo
di un virus a DNA doppio filamento.
RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DEI CICLI REPLICATIVI
(assenza di integrazione nel DNA della cellula
ospite)
Rappresentazione schematica del ciclo replicativo
di un virus a RNA singolo filamento. (Il
filamento viene replicato per intervento di un
filamento complementare e dà così origine ai
genomi della progenie virale e nel contempo
funge anche da RNA messaggero per la sintesi del
capside virale. Le proteine dellenvelope si
localizzano sulla membrana citoplasmatica della
cellula infetta nei siti da cui usciranno le
particelle virali che utilizzeranno la membrana
modificata come envelope).
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Integrazione nel DNA della cellula ospite
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Coltivazione dei virus

• I virus non possono essere coltivati allesterno
  di cellule viventi, per molto tempo la loro
  coltivazione è stata fatta su uova embrionate di
  pollo o in animale.
• Attualmente i virus vengono coltivati su
  monostrati cellulari associati con antibiotici
  che ne evitano la contaminazione.
• Nelle colture su monostrato cellulare compaiono
  aree di lisi definite placche che possono essere
  anche colorate.
• A volte non si ottengono regioni di lisi ma zone
  dove compaiono effetti citopatici ( a volte non
  accompagnati da placche).
• I batteriofagi vengono coltivati impiegando i
  batteri come coltura.
• Una coltura batterica torbida a contatto con il
  fago diventa limpida in conseguenza dellattività
  litica

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Purificazione dei virus e metodi di saggio

• Centrifugazione differenziale e in gradiente di
  densità (basata sullimpiego di un gradiente di
  saccarosio con raccolta delle particelle virali)
• Precipitazione dei virus con solfato dammonio
  concentrato e raccolta mediante centrifugazione.
• Denaturazione dei contaminanti con calore o pH.
  (tollerato dai virus).
• Digestione enzimatica delle componenti cellulari
  che non agiscono nei confronti delle particelle
  virali.

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Diagnostica virologica

• Saggio di emoagglutinazione. Basato sulla
  possibilità che i virus siano in grado di
  agglutinare i globuli rossi, fornendo un reticolo
  visibile in relazione alla loro diluizione, la
  diluizione virale più alta rappresenta il titolo
  virale.
• Conta delle placche, ogni placcasi origina dalla
  moltiplicazione virale.
• Conta delle particelle virali direttamente al
  microscopio elettronico
• Tecniche istopatologiche, sono le più antiche tra
  quelle usate nel laboratorio di virologia, si usa
  per questo un microscopio ottico (rabbia, corpi
  del Negri).
• Ricerca di antigeni virali si utilizzano sieri
  policlonali o anticorpi monoclonali. Specifici
  per proteine costitutive o non costitutive del
  virus. Il limite sta nel fatto che non sempre si
  può disporre dellanticorpo voluto e che non
  sempre si ha chiaro il quadro eziologico della
  malattia.
• Microscopia elettronica è una tecnica per
  individuare virus non noti o per ritrovare le
  particelle virali in colture di tessuto. Rimane
  comunque un metodo poco specifico e in parte
  anche poco sensibile.
• Metodi quantitativi e qualitativi per la ricerca
  di Ac. Nucleici virali PCR, ibridizzazione,

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Luso delle uova embrionate di pollo ha
rappresentato un metodo adottato grandemente in
passato per lo studio dei virus attualmente il
mezzo fondamentale per lisolamento e la
propagazione e lidentificazione dei virus
animali, è il monostrato cellulare .
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Nelle colture cellulari infette i segni della
moltiplicazione virale possono essere svelati con
le procedure più diverse. Per molti agenti
virali, si procede allesame microscopico diretto
delle colture infette. La replicazione virale può
indurre dei cambiamenti morfologici evidenti
delle colture cellulari. Si parla di effetti
citopatici, il tipo e la rapidità dello sviluppo
sono di grande aiuto per identificare i virus.
Le colture cellulari rappresentano attualmente il
mezzo fondamentale per lisolamento e la
propagazione e lidentificazione dei virus
animali, con luso di metodi appropriati hanno
consentito di condurre indagini sul ciclo
replicativo e sulle caratteristiche genetiche
dei diversi virus.
Leffetto citopatico più imponente è senza dubbio
al lisi cellulare un esempio è dato dagli
enterovirus che producono dopo poche ore
dallinfezione i cambiamenti morfologici della
coltura. Dopo 12 24 ore le colture cellulari
vengono distrutte completamente.
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(No Transcript)
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Epatiti virali

• Sono flogosi di natura infettiva che colpiscono
  il fegato.
• Sintomatologia soggettiva e oggettiva sfumata con
  forme fulminanti acute e croniche che possono
  esitare in cirrosi e carcinoma epatocellulare.
• I virus che possono determinare le epatiti virali
  si distinguono in minori e maggiori .
• I virus maggiori sono diversi tra loro non
  correlati geneticamente, e responsabili
  dellepatite infettiva e alimentare.

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VIRUS EPATITE VIRALE

• Virus A a RNA (HAV)
• Virus B a DNA (HBV)
• Virus C a RNA (HCV)
• Virus d a RNA (HDV)
• Virus E a RNA (HEV)

• utilizza il capside del HBV per la sua
  replicazione

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Epatite virale

• Lepatite A si trasmette per via oro fecale può
  contaminare acque e alimenti.
• Il virus dellepatite B è un hepadnavirus
  contiene tre antigeni di superficie, si trasmette
  per via parenterale, i 10 degli ammalati diventa
  portatore cronico, la diagnosi dimostra la
  presenza di precisi marcatori serici.
• I virus dellepatite delta, dell epatite c, sono
  virus a trasmissione parenterale.
• Il virus dellepatite in genere è un RNA virus
  che si trasmette in prevalenza con lingestione
  di acque infette, presente principalmente in Asia
  e Africa. E una malattia autolimitante.

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CARATTERISTICHE EPATITE A EPATITE B
Virione 27 nm involucro assenteRNA rassomiglia agli enterovirus 42 nm involucro presente DNAunico
Trasmissione Fecale - orale Iniezione parenterale ed altre
Periodi di incubazione 15-40 giorni 50-180 giorni
Periodo Autunno e inverno Tutto lanno
Epidemie Si No
Età di incidenza Più frequente nei bambini e nei giovani adulti Tutte letà
Caratteristiche della malattia Insorgenza acuta comune la febbre gt 38 ittero, etc. Insorgenza insidiosa la febbre gt 38 è poco comune ittero immunocomplessi, etc. più grave della forma A.
Epatite fulminante Si no
Epatite cronica attiva e cirrosi No Si
Virus nelle feci Dal periodo di incubazione fino a 1-2 settimane dopo la guarigione Assente
Virus nel sangue Dal periodo di incubazione fino a 1-2 settimane dopo la guarigione Dal periodo di incubazione fino a mesi o anni dopo la guarigione
HBsAg Assente Nel sangue 30-50 giorni dopo linfezione persiste da 60 giorni ad anni
Validità della profilassi con ? globuline Buona Inefficace a meno che non siano presenti alti titoli di HbS
Possibile causa di cancro al fegato no si
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EPATITE A
PERIODO DI INCUBAZIONE 15-40 GIORNI
4 6 SETTIMANE ITTERO, URINE SCURE, ETC. (O
ASINTOMATICA)
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EPATITE B
Antigeni di superficie HBsAg HBcAg (core) HBeAg
PERIODO DI INCUBAZIONE 50-180 GIORNI
4 6 SETTIMANE
MESI O ANNI
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Quadro sinottico degli aspetti clinici, epidemiologici e di decorso delle diverse epatiti virali Quadro sinottico degli aspetti clinici, epidemiologici e di decorso delle diverse epatiti virali Quadro sinottico degli aspetti clinici, epidemiologici e di decorso delle diverse epatiti virali Quadro sinottico degli aspetti clinici, epidemiologici e di decorso delle diverse epatiti virali Quadro sinottico degli aspetti clinici, epidemiologici e di decorso delle diverse epatiti virali Quadro sinottico degli aspetti clinici, epidemiologici e di decorso delle diverse epatiti virali
A B C D E
Incubazione in giorni 15-45 30-120 21-90 30-150 21-42
Inizio DI SOLITO ACUTO DI SOLITO INSIDIOSO DI SOLITO ACUTO SINTOMATOLOGIA NON SPECIFICA E ITTERO DI SOLITO ACUTO
Ittero 10 DA 15 A 20 VARIABILE 25 IGNOTO
Via di trasmissione orofecale CONSUETA ASSENTE ASSENTE ASSENTE ASSENTE
Via di trasmissione parenterale RARA CONSUETA CONSUETA CONSUETA CONSUETA
Altre vie di trasmissione ACQUA E CIBO (contaminazione fecale) ALTRI SECRETI(MUCOSITA) TRASMISSIONE PERINATALE RAPPORTI SESSUALI TRASMISSIONE MENO EFFICIENTE DI HBV IL RISCHIO AUMENTA CON LAUMENTO DEI RAPPORTI ACQUA E CIBO
Portatore cronico ASSENTE 5-10 DEI CASI PRESENTE CIRCA IL 50 DEI CASI IGNOTO
Epatite cronica NESSUN CASO NOTO NESSUN CASO NOTO
Mortalità 0,1 2 0,5 2 ANCHE MAGGIORE PIU DEL 30 NELLE FORME CRONICHE DA 1 A 2 ANCHE MAGGIORE 20 NELLE GRAVIDE, DA 1 A 2 NELLA POPOLAZIONE GENERALE
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(No Transcript)
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Complicanze da epatiti croniche

• Cirrosi epatica (lett. dal greco kirr
  giallastro -osi condizione). Malattia cronica
  del fegato, a varia etiologia (microrganismi,
  farmaci, alcol) con flogosi e necrosi del tessuto
  interstiziale, fibrosi e neoformazione di noduli
  di rigenerazione parenchimale i noduli,
  esercitando compressione ostacolano il flusso
  venoso epatico ai lobuli con ipertensione portale
  come complicazione. Seguono nel tempo altre
  complicanze (ascite, splenomegalia).
• Epatocarcinoma (lett. dal greco epar fegato
  karkin granchio oma). Tumore maligno del
  fegato originato dal tessuto epatico, può
  invadere ed ostruire la vena portale e vene
  sovraepatiche, causa nche metastasi al polmone ed
  ai linfonodi regionali. gt frequenza in adulti con
  cirrosi epatica e epatite cronica b e c .

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Epidemiologia disciplina che studia la
distribuzione degli eventi legati alle malattie
in gruppi di persone. Fornisce un utile
contributo per la comprensione della etologia
delle malattie e quindi per la loro
prevenzione. Endemia indica la presenza
costante di una malattia o di un microrganismo in
una particolare area o regione.

• Ittero condizione patologica caratterizzata da
  colorazione giallastra di cute, mucose e sclere
  che si verifica con bilirubinemia sup. a 2,5
  mg/dl (v.n. fino a 1). Littero epatocellulare
  origina per lesione tossica o infettiva degli
  epatociti con insufficiente captazione e
  coniugazione di bilirubina che si accumula nel
  sangue, si ritrova nelle urine (mobilina) che si
  presentano color marsala.

• Epidemia manifestazione a carattere episodico
  di una malattia , che si diffonde con frequenza
  più elevata rispetto ai casi attesi (indice di
  incidenza) in un certo tempo e area valutata per
  una data popolazione (es. epidemia influenzale).

• Limportanza dell epatite B non risiede tanto
  nella sua fase acuta quanto nei suoi effetti a
  lungo termine.
• Si può instaurare una viremia persistente con uno
  stato di portatore cronico che può durare anni.
• In alcuni individui ciò può portare ad epatite
  cronica ed infine a cirrosi cè anche un
  collegamento tra virus dell epatite B ed il
  carcinoma del fegato.

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Epatite virale B
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Rosolia

• Malattia acuta tipica dellinfanzia ad andamento
  quasi sempre benigno, incubazione media di 18
  giorni con esantema e linfoadenomegalia e con
  decorso subclinico
• Virus che si trasmette per via aerea viene
  eliminato durante gli ultimi giorni della
  incubazione e i primi giorni della malattia, dopo
  la replicazione nel tratto respiratorio il virus
  passa nel sangue e quindi agli organi bersaglio.
• Il rischio nella donna gravida è che il virus sia
  trasmesso al feto con danni di varia incidenza a
  carico degli organi ed anche aborto, rischio
  grave durante le prime 12 settimane di
  gravidanza, in questo caso la trasmissione al
  feto è molto frequente e nel 20 si ha aborto
  spontaneo.
• Presenza di IgG a causa di un infezione
  pregressa mentre nel caso di IgM linfezione è
  acuta e recente, linfezione fornisce un
  immunità permanente.
• Vaccinazione per tutti i bambini dopo i 15 mesi e
  per le donne in età fertile che non abbiano IgG
  specifiche contro la rosolia.
• Il vaccino essendo costituito da un virus
  attenuato non va somministrato a donne gravide in
  quanto potrebbe attaccare il feto.

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In questo caso non vi è trascrizione inversa l
RNA virale serve per la sintesi di un RNAm
direttamente che viene impiegato per la sintesi
di nuove proteine.
ROSOLIA CICLO DI REPLICAZIONE
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HIV (human immunodeficiency virus)

1. Malattia del sistema immunocompetente causata da
   due distinti retrovirus umani HIV 1 e 2
2. La fase asintomatica è notevolmente lunga in cui
   non si hanno manifestazioni patologiche ma in cui
   si realizza un forte calo del numero di CD4.
3. La sintomatologia inizia quando il n di CD4
   scende sotto le 300 unità per mm3
4. Antigeni si tratta di proteine strutturali
   denominate p24, gp41, gpl, gpl60, queste
   glicoproteine sono strutturali e in grado di
   legarsi ai recettori CD4 delle cellule
   linfocitarie t4 (helper suppressor). Il loro
   legame determina lingresso del virus allinterno
   del linfocita.
5. Gravi infezioni opportunistiche ed anche micosi
   esofagee e/o manifestazioni neoplastiche (sarcoma
   di Kaposi o linfoma del sistema nervoso
   centrale).
6. Nei soggetti non trattati con antvirali
   levoluzione è in media di 10 anni dal momento
   dellinfezione.
7. Periodo di incubazione tra 4 e 8 anni, si
   manifesta con poliadenopatia e linfoadenopatia
   cronica, il paziente può rimanere asintomatico
   per un lungo periodo.
8. La terapia è basata su sostanze farmaceutiche in
   grado di inibire la trascrittasi inversa, o le
   proteine di legame presenti sulla superficie del
   virus, o sostanze in grado di inibire i cofattori
   recettoriali.

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HIV (human immunodeficiency virus) CICLO DI
REPLICAZIONE
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(No Transcript)
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Ingresso dell HIV nella cellula, il legame tra
gp120 e CD4 è seguito dalla modificazione della
conformazione di gp120 che formano legami , l
agp41 completa lopera favorendo la fusione
dellenvelope