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CromatografiaScrittura del colore
Il termine cromatografia indica un insieme di
tecniche che hanno lo scopo di separare una
miscela nei suoi componenti, per permetterne il
riconoscimento qualitativo e quantitativo Le
tecniche sono molto utilizzate, permettendo
lanalisi di miscele complesse come sono la
maggior parte dei campioni di natura organica
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• Cenni storici
• 1903-1906 nascita Cromatografia grazie a un
  botanico russo (M. Tswett)
• 1938 introduzione della T.L.C. e della
  cromatografia a scambio ionico
• 1941 cromatografia di ripartizione
  liquido-liquido
• 1944 cromatografia su carta
• 1950 cromatografia a fase inversa
• 1951 gas-cromatografia
• 1959 cromatografia a permeazione di gel
• 1965 cromatografia liquida ad alte prestazioni

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• Principi della cromatografia
• la differente velocità di migrazione dei
  componenti costituenti una miscela (equilibrio
  dinamico)
• Fase mobile (MP), liquida o gassosa
• Fase stazionaria (SP), solida o liquida,
  stratificata su vetro o alluminio o impaccata in
  una colonna
• Fase fissa A Fase mobile
• Fase fissa B Fase mobile
• Fase fissa C Fase mobile
• Spostamento della fase mobile determina
  lavanzamento del soluto in essa contenuto mentre
  le molecole che sono distribuite nella fase
  stazionaria resteranno momentaneamente ferme

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XM ? Xs Soluto X migrerà con una velocità
proporzionale a Kx o coefficiente di
distribuzione tra le due fasi (dipendente dal
tempo che X spende nelle due fasi)
KA ? KB ? KC
Quale componente ha K maggiore?
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1
VA
VM VS KA
AS 0 A non ha alcuna affinità per la
fase fissa e si muove con il
fronte della fase mobile
AM 0 A non ha alcuna affinità
per la fase mobile per
cui si distribuisce completamente
nella fase fissa senza spostarsi
Riportando il segnale in funzione del tempo si
ottiene il cromatogramma
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Se Xf0 allora Vx è max e uguale alla Veluente
e il Volume delleluente necessario a eluire X è
pari al volume dello spazio interstiziale non
occupato dalla fase fissa detto volume
interstiziale o Vm. Se Xf?0 allora Vx è lt di
Veluente e il Volume delleluente necessario a
eluire X volume di ritenzione VR sarà maggiore
del Vm. Allora VR-Vm VR o volume netto di
ritenzione
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Tempo di ritenzione
Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega
un componente della miscela iniettata ad uscire
dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato
come picco dal detector.
tM t0 tempo morto tR tR - t0 tempo netto
di ritenzione, tempo trascorso da un dato
soluto nella fase stazionaria
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Relazioni che quantificano linterazione di un
dato soluto con la fase stazionaria VR tR . F
Vm t0 . F F (velocità di
flusso) FATTORE di CAPACITA V velocità lineare
media di migrazione di un soluto L/tR U
velocità lineare media di flusso della fase
mobile L/t0 V u . (frazione di tempo che il
soluto passa nella fase mobile) V u .
CM.VM/CMVMCSVS 1
1 CSVS/CMVM
V u .
1 1 K VS/VM
L/tR L/t0 .
tR t0 (1 K VS/VM) t0 (1 K)
Fattore di ritenzione o rapporto di distribuzione
di massa
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• k dipende
• dalla T
• dalla natura delle fasi
• dalle caratteristiche dellimpaccamento
• dalla granulometria e dallo spessore della fase
  stazionaria
• k non dipende
• dalla lunghezza della colonna
• dal flusso

Usato per confrontare le prestazioni di colonne
diverse a parità di eluente
La selettività quantifica lentità della
separazione fra due specie riguarda la capacità
di un sistema cromatografico di distinguere fra
due componenti ed è dipendente dalla
distribuzione relativa delle specie fra la fase
mobile e quella stazionaria, con (tR)Bgt (tR)A.
Fattore di separazione o Ritenzione relativa
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Parametri che descrivono quantitativamente
lefficienza di una colonna (ampiezza dei picchi)
Piatto teorico sezione della colonna che
consente di realizzare un equilibrio reversibile
di ripartizione di un componente fra le fasi.
Poiché in cromatografia si ha una sequenza
continua di stati di equilibrio e non vi è
possibilità di realizzare una singola
separazione, N ha un significato puramente
matematico. Più elevato è il numero di piatti
teorici, più grande è la probabilità di una
separazione (migliore è la capacità di
separazione della colonna). N è proporzionale
alla lunghezza della colonna.
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Separazione ottimale

1. separazione con scarsa risoluzione e basso N
2. migliora la risoluzione ma è sempre basso N
3. ottima risoluzione e buono N

Si può dimostrare che
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risoluzione scarsa per scarsa efficienza e
scarsa selettività
buona risoluzione dovuta a buona efficienza e
buona selettività
buona risoluzione dovuta a buona selettività, ma
efficienza non troppo elevata
risoluzione scarsa dovuta ad una basso
selettività.
Una buona risoluzione può derivare sia da una
buona efficienza (picchi molto stretti, elevato
numero di piatti teorici) sia da una buona
differenziazione del comportamento dei soluti
(selettività).
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Interazione soluto-fasi
Le interazioni che si verificano tra le sostanze
da separare e le due fasi (mobile e stazionaria)
sono deboli se così non fosse non ci sarebbe
trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al
contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo
separativo le seguenti interazioni

• legami a idrogeno
• interazioni dipolo-dipolo
• interazioni dipolo-dipolo indotto
• forze di Van der Waals
• formazione di composti di interazione
• attrazione coulombiana
• interazioni steriche

• Meccanismi di separazione
• ripartizione
• adsorbimento
• scambio ionico
• esclusione
• affinità

In tutte queste interazioni svolge un ruolo
solitamente decisivo la polarità delle due fasi.
Spesso possono essere presenti più tipi di
interazione nello stesso processo cromatografico
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Cromatografia
Fase mobile liquida
Fase mobile gassosa
CROMATOGRAFIA LIQUIDA (L.C.)
GAS-CROMATOGRAFIA (G.C.)
Fase fissa liquida
Fase fissa solida
CROMATOGRAFIA di ASSORBIMENTO (L.S.C.) Colonna/str
ato sottile
CROMATOGRAFIA di RIPARTIZIONE (L.L.C.) Colonna Str
ato sottile Carta
CROMATOGRAFIA a SCAMBIO IONICO (L.S.C.)
Colonna/strato sottile
GEL CROMATOGRAFIA Colonna/strato sottile
Fase mobile fluido supercritico
CROMATOGRAFIA di AFFINITA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA SUPERCRITICA (S.F.C.)
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RIPARTIZIONE
La fase stazionaria è un liquido che impregna un
solido granulare inerte (gel di silice) o è ad
esso chimicamente legato in questo liquido le
molecole da separare sono solubili la fase
stazionaria e la fase mobile devono invece essere
immiscibili. Durante leluizione le molecole si
ripartiscono dinamicamente tra le due fasi
secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla
quindi di cromatografia di ripartizione, che può
essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda
della natura della fase mobile.
Si-OH R-SiCl3 2 H2O
Si-O-Si(OH)2-R 3 HCl
La cromatografia di ripartizione è chiamata in
fase normale se la fase stazionaria è più polare
della fase mobile, mentre è chiamata fase inversa
se la fase stazionaria è meno polare della fase
mobile. Si tratta della tecnica più comunemente
impiegata per la separazione di sostanze organiche
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CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI RIPARTIZIONEdi
RIPARTIZIONE (L.L.C.)
In fase normale
Fase stazionaria polare Si-O-Si(R)2-CN Si-O-Si(R
)2-NH2
Fase mobile a bassa polarità Solventi
organici Soluzioni acquose (zuccheri, steroidi,
amminoacidi, proteine e peptidi)
In fase inversa
Fase stazionaria apolare Si-O-Si(CH3)2 Si-O-Si-C
H2-(CH2)6-CH3 Si-O-Si-CH2-(CH2)16-CH3
Fase mobile molto polare Soluzioni acquose o
tamponate Miscele acqua/metanolo/acetonitrile (amm
ine, vitamine, idrocarburi, analgesici)
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ADSORBIMENTO
La fase stazionaria è un solido in polvere (gel
di silice o allumina) sulla superficie dei
granuli si trovano siti attivi (-OH) che possono
stabilire legami deboli (reversibili!) con le
molecole della miscela da separare (ma anche con
le molecole dacqua, disattivandolo). Si parla
quindi di cromatografia di adsorbimento, che può
essere gas-solido o liquido-solido a seconda
della natura della fase mobile.
Per sostanze molto polari è preferibile usare gel
disattivati, mentre per sostanze con bassa
polarità si preferiscono le silici non
modificate. Le fasi mobili più usate in ordine
di polarità crescente e quindi di potere eluente
sono Esano, isottano, cloroformio, acetonitrile,
metanolo, acqua.
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SCAMBIO IONICO
La fase stazionaria è costituita da un polimero
inerte (resine sintetiche) contenente siti attivi
ionizzati o ionizzabili (gruppi funzionali acidi
o basici), i cui contro-ioni possono essere
scambiati con altri ioni aventi carica dello
stesso segno. Il meccanismo di separazione è
basato sulla competizione per i siti di scambio
tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli
presenti nel campione. Si parla di cromatografia
di scambio ionico (IEC)
Resina a scambio cationico -SO3H, -COOH Resina a
scambio anionico -NH2, -N(CH3)2 La fase mobile è
un tampone anionico (acetato) o cationico (tris)
contenenti ioni della stessa carica di quella dei
campioni (capacità di spostamento, pH, t )
La cromatografia a scambio ionico è impiegata per
la separazione di sostanze ioniche o ionizzabili
(amminoacidi, nucleosidi, nucleotidi)
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Fase stazionaria scambiatore cationico forte
polistirene solfonato Fase mobile tampone
citrato/acido citrico Eluizione con gradiente
di pH e forza ionica, ad esempio citrato/acido
citrico da pH 2 a pH 5 e di ioni Na da 0,2 a
0,4M. Gli aminoacidi vengono eluiti
sequenzialmente quando i valori del pH si
avvicinano al loro punto isoelettrico a pH
basso acidi (es. Asp, Glu) a pH neutro neutri
(es. Gly, Val) a pH basico basici (es. Lys,
Arg) Un analizzatore di amminoacidi contiene un
sistema continuo di registrazione dell'eluato
nel cromatogramma ad ogni picco corrisponde un
amminoacido.
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ESCLUSIONE DIMENSIONALE
La fase stazionaria è un solido poroso o un gel
di granulometria definita (acrilammide o
sephadex) per cui i campioni vengono separati in
base alla dimensione delle loro molecole. Le
molecole dellanalita, disciolte nella fase
mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni
sono compatibili e vi rimangono per un certo
tempo le molecole più grandi sono invece escluse
dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi
(la fase stazionaria si comporta da setaccio,
intervallo di PM).

• Si parla di cromatografia di esclusione
  dimensionale (SEC)
• Gel permeazione (GPC) per la separazione di
  sostanze insolubili in acqua
• Gel filtrazione (GFC) per la separazione di
  sostanze solubili in acqua
• La tecnica è impiegata per la separazione di
  molecole di grandi dimensioni (peptidi, proteine,
  polimeri)

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AFFINITA
In questo caso si utilizzano reazioni di tipo
biochimico, reversibili e molto specifiche, in
modo che le molecole da separare interagiscano
con la fase stazionaria a cui è chimicamente
legato un ligando specifico così da ottenere
leluizione selettiva di alcuni componenti della
miscela. Si parla di cromatografia di affinità
(AFC). Ligandi tipici sono substrati di reazioni
enzimatiche, inibitori, cofattori, recettori,
basi di sequenza complementari, ormoni,
anticorpi, ecc Le matrici più utilizzate sono
lagarosio, la poliacrilammide, il destrano, la
cellulosa scarse interazioni aspecifiche, buone
proprietà di flusso, gruppi chimici modificabili,
stabilità a variazioni di pH e di temperatura.
La cromatografia di affinità è impiegata nella
separazione di molecole di interesse
prevalentemente biochimico
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Cromatografia classica su colonna Le colonne
impiegate sono generalmente in vetro e possono
essere di varie dimensioni secondo le
esigenze. Il riempimento della colonna può essere
costituito da materiale solido adsorbente,
finemente suddiviso, asciutto e scelto
opportunamente in base alla separazione da
effettuare (per LSC) oppure la colonna viene
riempita con supporto granulare inerte,
generalmente gel di silice, che viene impregnato
con solvente opportuno e che costituirà la fase
fissa (per LLC) o ancora una resina a scambio
ionico per cromatografia ionica. Il solvente
scelto, contenente la miscela da separare, viene
fatto fluire attraverso la colonna.
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HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Il metodo strumentale della cromatografia liquida
ad alta pressione è frutto dellevoluzione
tecnologica delle tecniche di cromatografia su
colonna. I principi sono sempre quelli
delladsorbimento e della ripartizione, ma le
fasi stazionarie sono impaccate in colonne
chiuse, con materiali di granulometria molto fine
(3-10 mm) e controllata in tal modo viene
aumentata la superficie di contatto fra fase
mobile e fase stazionaria e limpaccamento
diviene più omogeneo. Utilizzando queste colonne
è necessario che la fase mobile venga fatta
fluire ad alta pressione perché, attraverso
colonne con impaccamento a granulometria così
fine, il flusso delleluente diventa molto
lento. Con limpiego di pompe particolari, capaci
di applicare pressioni di 50-150 atm, diventa
possibile ottenere flussi di alcuni ml/min,
sufficienti ad ottenere leluizione in tempi
ragionevolmente brevi.
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HPLC - Vantaggi rispetto alla LC classica
velocità, risoluzione e sensibilità superiori

• crom.classica a colonna aperta riempita con
  particelle grandi, porose (d 100 mm, D 20-50
  mm, L 200-100 cm)
• HPLC con riempimento pellicolare (d 40-70 mm, D
  1-3 mm, L 50-100 cm)
• HPLC con riempimento di microparticelle (d 5-10
  mm, D 2-6 mm, L 10-50 cm)
• d diametro particelle D diametro colonna L
  lunghezza colonna

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LC classica 1) dimensione delle particelle e
diametro interno della colonna molto maggiori che
nella HPLC 2) velocità di flusso molto basse 3)
tempi di analisi lunghi
Cercando di aumentare la velocità del solvente,
diminuiscono efficienza e risoluzione a causa del
limitato trasporto di massa nei pori profondi e
nei lunghi canali interparticellari.
Per favorire il flusso della fase mobile è quindi
necessario luso di pompe ad alta pressione.
Efficienza aumentata di 10-100 e tempi di
separazione diminuiti (miglioramento nei termini
di trasporto di massa della fase stazionaria e
della fase mobile).
HPLC 1) impaccamento di dimensioni molto
inferiori, compresso in colonne sottili 2)
contropressioni maggiori 3) tempi d analisi
contenuti
La pressione dipende da diversi paramentri ?
viscosità del solvente V velocità lineare di
flusso L lunghezza della colonna K costante
legata alle caratteristiche fisiche del
riempimento della colonna d diametro della
colonna
1 pascal 1 newton/m2 1x105 bar 1 bar 0,9869
atm 1,01 Kg/cm2
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Le colonne per HPLC sono in acciaio o in
plastica, lunghe 5-30 cm e con diametro interno
di 1-5 mm. Le colonne sono costose e vengono
facilmente danneggiate da polvere o da particelle
o impurezze presenti nel campione e nel solvente.
È per questo che è necessario proteggere
lingresso della colonna principale con una
pre-colonna che contiene la stessa fase
stazionaria della colonna principale, ma è più
corta e può venire periodicamente sostituita.
La fase stazionaria più comune è costituita da
particelle microporose di silice ad elevata
purezza, permeabili al solvente e con elevata
area superficiale (alcune centinaia di m2/g).
Questa fase stazionaria viene generalmente
impiegata per cromatografia di adsorbimento. Più
comunemente, si realizza la cromatografia di
ripartizione impiegando fasi stazionarie legate,
ossia fissate covalentemente alla superficie
della silice.
Fasi polari comuni Fasi polari comuni Fasi non polari comuni Fasi non polari comuni
R (CH2)3NH2 ammino R (CH2)17CH3 ottadecile
R (CH2)3CN ciano R (CH2)7CH3 ottile
La C18 (anche indicata con ODS) è la fase
stazionaria di gran lunga più utilizzata in HPLC
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• sistema di iniezione costituito da una valvola a
  più vie e da un circuito a volume fisso, o loop,
  nel quale si mette il campione

• pompa con pressione fino a 400 Atm, flusso
  stabile tra 0.1 e 10 ml/min

• colonna cromatografica ed eventuale precolonna
• rivelatore per monitorare gli eluati
• PC per gestire il sistema e i dati

• riserva di solventi uno o più solventi che
  possono essere utilizzati singolarmente o in
  miscela

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Eluizione isocratica e a gradiente
Variazione continua della composizione del
solvente per aumentare la forza eluente. Una
forza eluente crescente è necessaria per eluire i
soluti più fortemente trattenuti e per migliorare
le separazioni.
Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi
di composizione costante.
SOLVENTE DEBOLE
SOLVENTE FORTE
FORZA INTERMEDIA
GRADIENTE DI SOLVENTE
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• Sistemi di rivelazione
• Sensibilità adeguata al problema
• Buona stabilità e riproducibilità
• Risposta lineare al soluto, possibilmente per
  parecchi ordini di grandezza
• Tempi di risposta rapidi
• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta
  selettiva verso una o più classi di soluti

Rivelatore LOD (ng) Selettività Utilizzabile in gradiente?
Assorbimento UV 0.1-1 selettivo SI
Indice di rifrazione 100-1000 generale NO
Fluorescenza 0.001-0.01 selettivo SI
Elettrochimico 0.01-1 selettivo NO
Conduttimetrico 0.5-1 selettivo NO
Assorbimento IR 1000 selettivo SI
Spettrometro di massa 0.1-1 generale SI
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GAS-CROMATOGRAFIA
In gascromatografia (Martin e Synge 1941 e poi
James e Martin 1952) la fase mobile è un gas che
fluisce in una colonna in cui è posta la fase
stazionaria.I meccanismi di separazione dei
componenti la miscela sono determinati dalla fase
stazionaria, poiché quella mobile funziona
solamente da gas di trasporto(carrier).Condizion
e indispensabile per operare unanalisi
gascromatografica su una miscela è che essa sia
in grado di passare in fase vapore alla
temperatura di lavoro.
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• VANTAGGI DELLA GC
• Poco costosa
• Altamente sensibile (10-9 - 10-13 g/mL)
• Robusta
• Riproducibile
• Rapida
• Separazione di mix complesse (100 analiti in
  GC-capillare)

SVANTAGGI DELLA GC Non applicabile allanalisi di
macromolecole, sostanze termolabili, altamente
polari o idrofile
Cromatografia di adsorbimento gas-solido (fase
stazionaria solido adsorbente) Cromatografia
di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria
liquido che può essere supportato da un solido
inerte o depositato sulle pareti della colonna) A
differenza della LC, la fase mobile non ha
effetto competitivo il gas di trasporto o
CARRIER serve solo per trascinare i componenti
lungo la colonna.
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• Trattamento del campione
• Derivatizzazione usata per sostanze altobollenti
• Reagenti sililanti
• HMDS esametildisilazano (zuccheri)
• TMCS trimetilclorosilano (acidi carbossilici)
• BSA bistrimetilsililacetamide (alcoli, ammine,
  acidi carbossilici, fenoli, steroidi,
  alcaloidi)
• BSTFA bistrimetilsililtrifluoroacetamide (come
  BSA froma deivati poù volatili)
• Reagenti acilanti
• TFAA anidride trifluorometansolfonica (alcoli,
  fenoli, ammine)
• PFPA anidride pentafluoropropionica (alcoli,
  fenoli, ammine)
• HFBA anidride eptafluorobutirrica (tioli)
• Reagenti alchilanti
• TMPAH idrossido di trimetilanilinio (COOH, NH2,
  OH, barbiturici, sedativi, basi xantiniche,
  alcaloidi fenolici)
• BF3 in etanolo (acidi grassi dei trigliceridi)
• PFBBr pentafluorobenzilbromuro (acidi, fenoli,
  tioli e solfonammidi)

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SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO
He, Ar, N2
51
SISTEMA DI INIEZIONE

• FUNZIONI
• Introduzione del campione
• Evaporazione del campione
• Ingresso del gas di trasporto
• Collegamento alla colonna

Lentrata deve essere ad una temperatura
sufficientemente elevata da permettere
levaporazione istantanea del campione e
abbastanza grande da permettere al vapore di
espandersi senza essere spinto indietro.
Nelle colonne impaccate, il campione (max 0,5 mL)
viene introdotto direttamente nel flusso del
gas-carier atttarverso una camera di iniezione
che assicura la immediata vaporizzazione della
miscela (T 50-100C). Nelle colonne capillari,
la quantità che arriva in colonna è invece
notevolmente inferiore (fino a 100 volte) e
questo può essere realizzato con vari tipi di
valvole.
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COLONNE Per gas-cromatografia
canalicoli dellimpaccata
Le impaccate (acciaio, vetro o rame) contengono
particelle solide inerti di appropriata
granulometria, eventualmente imbevute della fase
stazionaria liquida (diametro 0.75 - 4 mm
lunghezza 6 m) . Le capillari sono tubi molto
più sottili e lunghi (diametro 0.1 - 0.75 mm
lunghezza 15-300 m) in cui la fase stazionaria
è depositata sulle pareti interne. Queste ultime
hanno un elevato numero di piatti teorici (anche
300.000) grazie alla loro elevata lunghezza.
WCOT wall-coated-open-tubular
SCOT support-coated-open-tubular
unico canalone della capillare
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(No Transcript)
54
Le fasi stazionarie più usate in GC di
adsorbimento sono Gel di silice Allumina Carbone
attivo Carbone grafitizzato Microparticelle
sferiche di carbone Zeoliti Sali inorganici
I supporti inerti più usati in GC di ripartizione
sono Terra di Diatomee Teflon Microsfere di
vetro Le fasi stazionarie più usate (ancorate,
legate) sono Idrocarburi Esteri e
poliesteri Polieteri Ammidi, ecc.
Influenza della temperatura sulla corsa
cromatografica

• Normalmente la temperatura della colonna è
  regolata sul valore corrispondente alla media dei
  punti di ebollizione dei componenti della
  miscela.
• Per miscele particolarmente complesse con punti
  di ebollizione troppo distanti tra di loro la
  scelta della temperatura è problematica.

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• Per tali miscele un temperatura troppo alta
  consentirebbe una buona separazione dei
  componenti altobollenti ma ammasserebbe quelli
  più bassobollenti.

• Al contrario, una temperatura troppo bassa, non
  consentirebbe di separare quelli altobollenti.

56
Nei moderni strumenti la programmazione è di tipo
lineare, e prevede le seguenti tappe Isoterma
iniziale indica quanto tempo si rimane a una
determinata temperatura. Fase di rampa si
stabilisce la temperatura da raggiungere e con
quale velocità. Isoterma finale indica il tempo
che si deve restare alla temperatura più
alta. Raffreddamento si attua dopo la fine della
registrazione del cromatogramma
57
45
145
programma di T
58

• Sistemi di rivelazione
• Sensibilità adeguata al problema
• Buona stabilità e riproducibilità
• Risposta lineare al soluto, possibilmente per
  parecchi ordini di grandezza
• Tempi di risposta rapidi
• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta
  selettiva verso una o più classi di soluti

Rivelatore Selettività
Termoconducibilità TCD Non selettivo Insostituibile per lanalisi dei gas
Ionizzazione di fiamma Poco selettivo
Azoto-fosforo (NPD) o a fiamma alcalina selettivo
A Cattura di elettroni (ECD) Selettivo Organofosforici, diossine, benzodiazepine
Spettrometro di massa generale
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Limite di linearità è la concentrazione massima
al di là della quale il segnale non è più
proporzionale alla concentrazione (con una
tolleranza del 5).
Intervallo di linearità range di concentrazioni
compresa tra il limite di rivelabilità e il
limite di linearità.
Intervallo di risposta dinamico intervallo
di concentrazioni entro il quale il rivelatore
risponde, anche se non in maniera lineare
Limite di rivelabilità è la concentrazione
minima che dà una risposta doppia del rumore di
fondo
Limite intervallo di risposta dinamico oltre
questa concentrazione non si possono fare misure
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Riassumendo

• analiti volatili o volatilizzabili, termicamente
  stabili, non ionici
• ?
• Gascromatografia
• analiti non volatili o poco volatili, ionici,
  ionizzabili o non ionici, termicamente instabili
• ?
• Cromatografia liquida

61
La Radiazione Elettromagnetica è costituita da un
campo magnetico e da un campo elettrico
oscillanti su due piani perpendicolari alla
direzione di propagazione dellonda. Parametri
che descrivono la natura ondulatoria
dellonda -Lunghezza donda l distanza tra i
due massimi o tra i due minimi. -Ampiezza donda
in valore assoluto la distanza tra la direzione
di propagazione dellonda e il punto di max o di
min. -Frequenza u numero di onde che passano un
dato punto nellunità di tempo. La descrizione
quantitativa delle interazioni tra la radiazione
e la materia è possibile solo se si considera la
radiazione come formata da quantità discrete,
chiamate FOTONI. Lenergia dei fotoni è
proporzionale alla frequenza della radiazione.
62
SPETTROSCOPIA E la disciplina che studia
lINTERAZIONE delle radiazioni elettromagnetiche
con gli stadi quantici di energia della
materia. In virtù di questa interazione, si
determina una variazione dellenergia che può
interessare nuclei, elettroni, atomi o molecole.

• assorbire la radiazione gt il suo contenuto
  energetico (SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO)
• emettere la radiazione lt il suo contenuto
  energetico (SPETTROSCOPIA di EMISSIONE)
• diffondere la radiazione (SPETTROSCOPIA RAMAN)

Tutti questi tipi dinterazione possono avvenire
solo per determinate l della radiazione incidente
e quindi solo per determinate u. hu E-E
differenza di energia tra i due stati del sistema.
63
(No Transcript)
64

• SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO
• Processo mediante il quale una sostanza rimuove
  selettivamente alcune frequenze dalla radiazione
  elettromagnetica.
• Lo spettro non è altro che la rappresentazione
  grafica delle transizioni energetiche permesse
  (Regole di selezione) sotto forma di righe.
• Transizioni elettroniche ETOT Ee Ev Er
  Et
• Transizioni vibrazionali
• Transizioni rotazionali
• Transizioni traslazionali

65
TRANSIZIONI Rotazionali Vibrazionali Elettroniche
Onde Radio Variazioni di energia troppo deboli
per essere osservate se non sotto un intenso
campo magnetico STATI di SPIN INDOTTI
MAGNETICAMENTE EPR (elettroni) NMR (nuclei)
Visibile, Ultravioletto, Raggi X
Infrarosso
Infrarosso lontano, microonde
66
La legge dellassorbimento o Legge di Beer

• E la legge sperimentale che descrive i fenomeni
  di assorbimento delle radiazioni
  elettromagnetiche in generale e con particolare
  riferimento alle soluzioni.
• A e . b . C
• A assorbanza o frazione di energia assorbita
• b cammino ottico (cm), spessore della soluzione
  attraversata dal raggio
• c concentrazione (mol/L) della specie in esame
• assorbività o coefficiente di estinzione
  molare o di assorbimento molecolare
  (IUPAC), cioè lassorbanza a concentrazione e
  spessore unitari.
• (l, dal solvente, dalla natura chimica della
  specie che assorbe non dipende in generale
  dalla temperatura)
• Se e è costante e b (cammino costante) allora
  lequazione assume la forma A kc e quindi del
  tipo y mx.

67
Altro modo per descrivere il fenomeno
dellassorbimento consiste nellusare la
definizione di Trasmittanza T I/I0 T
trasmittanza I0 intensità della radiazione
incidente I intensità della radiazione che esce
dal campione Questa grandezza è legata
allAssorbanza secondo la relazione A log 1/T
log I0/I Se T 100T A log 100/T 2-log T
oppure T 102-A A varia tra 0 e infinito mentre
T varia tra 0 e 100.
68

• Fattori che possono determinare deviazioni dalla
  linearità
• Concentrazione della soluzione (10-2/10-7), se
  troppo concentrata si può avere una variazione
  dellindice di rifrazione e quindi di e, così
  come si possono formare coppie ioniche o
  complessi o aggregati.
• Variazioni di pH, perché influenza lequilibrio
  tra due forme della stessa sostanza, aventi e
  diverso ad una stessa l.
• Temperatura, perché influenza sempre un eventuale
  equilibrio tuttavia variazione nellordine di 5
  C non comportano particolari problemi.
• Solvente, perché la polarità del solvente
  influisce sulla distribuzione elettronica nella
  molecola analizzata. Ad es solventi polari o con
  alta costante dielettrica esercitano un effetto
  batocromo.
• Co-presenza di fenomeni di fluorescenza
  (emissione) e diffusione della radiazione.
• Fattori strumentali (ampiezza della banda
  passante)

69
Spettri di assorbimento e scelta della lunghezza
donda per la misura dellassorbanza
Una sostanza assorbe in modo diverso le varie
radiazioni, cioè a diverse l corrispondono vari
e. Lo spettro di assorbimento che si ottiene è
uno spettro a bande caratterizzato dalla presenza
di massimi (picchi di assorbimento) e minimi.
Ogni sostanza ha un suo spettro caratteristico
ed è proprio individuando la posizione dei
massimi caratteristici che si realizza lanalisi
qualitativa. Lanalisi quantitativa viene invece
fatta scegliendo unopportuna l, detta lunghezza
donda analitica, scelta in modo che corrisponda
ad un max o ad un min.
70
Transizioni elettroniche e cromofori
Lassorbimento nel campo UV-VIS è dovuto a
transizioni elettroniche da orbitali di legame a
orbitali di non-legame o di anti-legame a più
alto contenuto energetico e questo è possibile
solo se la radiazione possiede unenergia pari al
DE tra i due livelli.
p
p
n
p
Le prime sono caratteristiche dei sistemi
insaturi e le seconde di eteroatomi con doppietti
liberi sistemi di questo tipo sono indicati come
cromofori.
CC, CC, CO, CN, CS, NO, NN, polieni,
aromatici, ecc
71
Effetto dei sostituenti
Effetto Batocromo diminuisce il DE della
transizione, alzando il contenuto energetico
dellorbitale legante o diminuendo quella
dellorbitale anti-legante o non-legante. Il
picco (lassorbimento) viene spostato a l
maggiori (sostituenti e- ricchi o
donatori). Effetto Ipsocromo effetto opposto al
precedente aumenta il DE e quindi diminuisce la
l dellassorbimento (sostituenti e- poveri o
elettronegativi). Effetto Ipercromico risulta
aumentato e o per aumento della probabilità che
avvenga quella data transizione o per aumento
della superficie del cromoforo aumenta
lassorbanza ma rimane costante la l a cui il
composto assorbe. Effetto Ipocromico effetto
opposto al precedente diminuzione di e e quindi
dellassorbanza.
72
Rivelatore UV a l fissa
Vantaggi e svantaggi Il principale vantaggio è il
basso costo. Inoltre lelevata intensità della
radiazione della lampada a Hg permette di
ottenere elevata sensibilità per composti che
assorbono a 254 nm. Il principale svantaggio è
determinato dalla scarsa selettività dovuta alla
necessità di lavorare a l fissa.

• Vantaggi
• Versatilità possibilità di selezionare l da 190
  a 800 nm.
• Elevata sensibilità potendo scegliere la l
  ottimale (max assorbanza) per un analita.
• Selettività quando si hanno sovrapposizioni di
  picchi si può variare la l in modo tale da
  minimizzare lassorbimento degli interferenti.
• Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione,
  scegliendo una l alla quale la miscela solvente
  non assorbe.

Rivelatore UV a l variabile
73
Dopo unora
74
Separazione di una tossina proteica, della
tossina coniugata con la biotina e dellavidina
(fattore antinutrizionale)
Avidina Glicoproteina dellalbume che impedisce
lassorbimento della biotina
Biotina (IUPAC) Vitamina H o I (tedesca) Vitamina
B7 (anglosassone) Vitamina B8 (francese)
75
Spettrometro di Massa
Lo spettrometro di massa può fornire informazioni
qualitative e quantitative sui componenti della
miscela analizzata mediante HPLC. Per ottenere
uno spettro di massa, le molecole portate in fase
gassosa, vengono ionizzate. Gli ioni sono quindi
accelerati per mezzo di un campo elettrico e
vengono poi separati in base al loro rapporto
massa/carica (m/z). Laccoppiamento HPLC-MS è una
tecnica relativamente giovane e sempre più
utilizzata. Lo MS in un sistema integrato HPLC-MS
può servire come rivelatore universale (o
comunque come un rivelatore che risponde ad
unestesa gamma di soluti) e sensibile. Laccoppia
mento HPLC/MS è stato tentato già molti anni fa
(fine anni 60), ma soltanto dalla metà degli
anni 70 appaiono le prime pubblicazioni
scientifiche. Le difficoltà di tutti i metodi
HPLC-MS derivano dal fatto che in HPLC si
utilizzano solventi molto diversi, in funzione
del tipo di analisi, (es. acqua, solventi
organici, tamponi) inoltre i flussi in LC sono
molto elevati rispetto a quelli richiesti per lo
spettrometro di massa. Per accoppiare le 2
tecniche sono pertanto necessarie opportune
interfacce che oltre a ridurre i flussi dovranno
consentire anche la vaporizzazione degli analiti
mediante riscaldamento.
76
1) il sistema di entrata 2) la sorgente ionica,
il cuore dello spettrometro, in cui le molecole
neutre vengono trasformate in ioni e si
frammentano 3) lanalizzatore, in cui gli ioni
vengono separati in funzione del rapporto
massa/carica (m/z) 4) il rivelatore, in cui gli
ioni vengono raccolti ed i segnali inviati, dopo
amplificazione, al registratore che converte le
informazioni contenute nei segnali in uno spettro.
Campo magnetico analizzatore
fascio ionico
analita
Camera di ionizazione
Campo elettrico acceleratore
77
Spettrometro di Massa a Quadrupolo Iperbolico
78
(No Transcript)
79
1) M e- M 2e-
M1
M3 2) M
M2 M4 , etc.

Ogni molecola ha una frammentazione unica e
caratteristica che, come una vera e propria
impronta digitale, ci permette di identificare e
di risalire alla molecola madre.
Abbondanza relativa
Normalizzazione dei picchi
50 100
150 200 massa relativa
80

1. Formazione ione molecolare (parente)
2. Formazione ioni di frammantazione
3. Formazione di ioni di riarrangiamento
   (trasposizione)

AB e- AB. 2e-
PM
AB. A B. catione
radicale A C D catione
molecola neutra AB. EF. D
ione radicale molecola neutra
Informazioni sulla struttura (identificazione dei
composti)
La presenza di picchi isotopici, aventi quindi
rapporto m/z M 1 (o 2, 3, 4, ecc) con
intensità proporzionale allabbondanza isotopica
naturale
81

• Tre requisiti (necessari, ma non sufficienti)
  perché un picco sia effettivamente lo ione
  molecolare
• Picco a massa più alta
• Ione ad elettrone dispari (ione radicalico)
• Spiegare tutti gli ioni più importanti nella zona
  delle masse alte dello spettro in base a perdite
  logiche di specie neutre.
• Grado di insaturazione (n di anelli n di
  legami)
• X ½ Y ½ Z 1
• CxHyNzOn

C6H6 6 - 3 1 4 (1 anello 3
legami) C7H5O 7 ½ 5 1 5,5
82

• Regola dellazoto
• Ione molecolare pari 0, 2, 4, . n di N
• Ione molecolare dispari 1, 3, 5, .n di N
• (azoto ha massa pari ma valenza dispari)
• Analisi dei picchi isotopici
• M2 stessa intensità di M 1 atomo di Br
• M2 33 intensità di M 1 atomo di Cl
• M2 4 intensità di M 1 atomo di S
• M2, M4, M6,.. 2, 3,.atomi di Br, Cl,..

83
(No Transcript)
84

• Frammentazione
• Ioni neutri non vengono rivelati ma possono
  essere individuati indirettamente dalla
  differenza di massa tra lo ione molecolare e lo
  ione frammento vicino.
• Es.
• Perdite di 1, 2, 3 sono plausibili
• Perdite tra 4-14 no
• Perdita di 15 palusibile (CH3)
• Perdite tra 21-25 no
• Tipi di ionizzazione
• Elettronica (E.I.)
• Chimica (C.I.)
• di campo (F.I.)
• Disassorbimento di campo (F.D.)

85

• E.I.
• Gli ioni vengono generati per interazione con e-
  ad alta energia emessi da un filamento di
  tungsteno o renio portato allincandescenza per
  riscaldamento elettrico.
• (Alta frammentazione, bassa intensità dello ione
  molecolare)
• 2)C.I.
• Gli ioni vengono generati per interazione con
  ioni derivanti dalla ionizzazione elettronica di
  un gas reagente (metodo soft di ionizzazione)
  metano, isobutano, ammoniaca.
• (Oltre alla ionizzazione si ha il trasferimento
  di un protone per cui si formerà MH minore
  frammentazione)
• 3)F.I. e F.D.
• in entrambi i metodi gli ioni sono generati da
  un forte campo elettrico che si instaura a causa
  della forte differenza di potenziale tra due
  elettrodi (metodo soft di ionizzazione) cambia
  il sistema di introduzione del campione che
  nellF.D. è deposto direttamente in soluzione
  sullanodo (miglioramento dellefficienza, picco
  M o MH intensi)

86
E.S.I. Electro spray ionization E il metodo di
ionizzazione che più di frequente si
trova accoppiato allLC, potendo utilizzare
campioni liquidi o solidi, scarsamente volatili o
termolabili (soft ionization). Molecole con PM
relativamente alto Presenza di legami deboli e
labili Elevata sensibilità
Il campione liquido viene spruzzato sotto
pressione e le goccioline caricate dal potenziale
applicato al capillare. Nella camera di
evaporazione, il gas e il riscaldamento fanno
evaporare e desolvatare le goccioline cariche.
Aumenta la densità di carica fino allesplosione
in goccioline più piccole caricate positivamente
o negativamente.
87
Quattro barre cilindriche parallele due caricate
positivamente e due negativamente collegate a due
a due ad un generatore di potenziale
elettrostatico e a un generatore di
radiofrequenze (variabile nel tempo).
Gli ioni subiscono lazione combinata dei due
campi. Per un certo valore del rapporto
Potenziale elettrostatico/radiofrequenza solo
ioni aventi un determinato rapporto m/z riescono
a passare oltre al quadrupolo e arrivare al
rivelatore. Occorre fare una scansione, cioè far
variare il potenziale elettrostatico e la
radiofrequenza ma mentenere costante il loro
rapporto. Semplicità costruttiva range di masse
più stretto Minor costo minore
risoluzione Tollera pressioni maggiori (LC,
GC) Maggiore velocità di scansione
88
(No Transcript)
89
CUMARINA (1,2-BENZOPIRONE)
Warfarin (Cumadin) Attività anticoagulante Inte
rferisce con le funzioni della vitamina K,
coinvolta nellattivazione Dei fattori della
coagulazione del sangue
7-idrossicumarina (Umbelliferone) Attività
chemoprevenzione del cancro
6,7-dimetossicumarina (Scoparone) Attività
antiossidante, vasorilassante, antiasmatico
Psoralene (furanocumarina lineare) Attività
cura di eczemi e psoriasi
Angelicina (furanocumarina angolare) Attività
antiinfiammatoria
90
Analisi GC-MS della 5,7-dimetossicumarina standard
OCH3
H3CO
M - CH3 191 M - CO 178 M - CH3CO 163 M
- CH3CO CH3 148 M - CH3CO CO 135 M -
CH3CO CH3CO 120
91
Identificazione della 5,7-dimetossicumarina
nellESTRATTO in METANOLO
OCH3
H3CO
5,7-dimetossicumarina
92
(No Transcript)
93
Cromatografia
Cromatogramma
tempo di ritenzione (spettro di massa)
area del picco
Analisi qualitativa
Analisi quantitativa
94
ANALISI QUALITATIVA

• -tr sostanza X e tr sostanza nota (standard)
• -Iniettare una certa quantità (10-20) della
  sostanza presunta, pura, nel campione in esame
  se il picco di X risulta aumentato vi è buona
  probabilità di aver individuato lidentità
  dellincognito.
• Stessa cosa viene ripetuta usando condizioni
  sperimentali diverse se anche in questo caso
  larricchimento fa aumentare il picco allora
  siamo quasi certi dellidentità della sostanza.

• Se ho accoppiato uno spettrometro di massa si può
  evitare questa procedura macchinosa.

95
ANALISI QUANTITATIVA

• Lanalisi quantitativa cromatografica è basata
  sulla misura delle aree dei picchi, dal momento
  che esiste proporzionalità diretta tra la misura
  effettuata e la concentrazione che la determina
  (almeno in certi range).
• Sono metodi comparativi cioè basati sulla
  relazione matematica tra il parametro misurato
  (risposta o segnale) e la concentrazione
  dellanalita.
• Quindi richiedono la calibrazione mediante
  soluzioni standard.
• Dopo opportuna elaborazione delle aree, si
  risale alla concentrazione percentuale dei
  componenti.
• Il calcolo dellarea del picco viene fatta
  direttamente dal computer e viene stampata sul
  cromatogramma.
• Alla base comunque ci sono delle regole per
  mezzo delle quali è possibile risalire alle aree
  dei picchi.
• Necessità di determinare quantitativamente tutti
  i componenti di una miscela o solo alcuni o al
  limite uno solo (necessità quindi di avere
  risolti tutti i picchi, solo alcuni, uno solo).

96

• Ritagliare il picco e pesarlo, confrontandolo con
  il peso di 1 cm2 della stessa carta.
• Metodo laborioso
• Precisione

massa picco
area picco
massa 1 cm2

• Metodi geometrici
• Gaussiana
• Triangolazioni
• Importante è la
• pulizia del picco
• (simmetria e
• mancanza di
• sovrapposizioni)

97
Si applica il metodo della gaussiana calcolando
lampiezza del picco a metà altezza e
considerando i due picchi come separati.
In questo caso lampiezza a metà altezza è
ricavabile dalle semi-ampiezze. Lintegrazione
elettronica ricostruisce la funzione matematica
del picco maggiore, ne calcola larea e la
sottrae allarea totale (area del picco minore)
98

• I metodi per la calibrazione possono essere
  divisi in due gruppi
• Uso di Standard Esterni (analizzati
  separatamente dal campione).
• Uso di Standard Addizionati ad ogni campione
  (Standard Interni o aggiunti).

• Standard esterni
• Una serie di standard di questo tipo è costituita
  da unità che contengono quantità note e
  differenti di analita.
• Si inietta un volume noto e preciso del campione
  e si registra il cromatogramma poi, si prepara
  una soluzione a concentrazione nota del
  componente da determinare e si inietta lo stesso
  volume, registrando il cromatogramma.

S(A)c/S(A)s Cc/Cs
Cc Cs . S(A)c/S(A)s
99

• E importante fare in modo che le concentrazioni
  comparate (campione e standard) non differiscano
  troppo tra loro.
• Occorre una grande accuratezza e riproducibilità
  nel misurare il volume da iniettare.
• Iniezioni ripetute, sia del campione che dello
  standard, e poi fare una media delle aree
• Le iniezioni vanno effettuate in un intervallo di
  tempo piuttosto breve per evitare le deviazioni
  dovute a variazioni ambientali o strumentali.
• Costruzione di rette di taratura o calibrazione
• Si preparano diverse soluzioni (da 3 a 5) a
  concentrazioni note e crescenti dellanalita e si
  riportano su un grafico A/ i valori letti sul
  cromatogramma si dovrebbe ottenere una retta
  passante per lo zero (se ci sono deviazioni
  significative allora si aumenta il numero delle
  soluzioni standard).
• Si inietta la soluzione campione e si registra il
  valore dellarea. Si interpola la concentrazione
  incognita del campione.

100

• Le soluzioni standard devono simulare al meglio
  la matrice del campione, e quindi devono
  contenere tutti i reattivi (e nelle stesse
  concentrazioni) contenuti nella soluzione
  campione. Questo comporta ricontrollare le rette
  di taratura ogni volta che le soluzioni dei
  reattivi vengono preparate di fresco.
• Conoscenza della matrice
• I vari componenti la matrice non causino
  interferenza con il campione

101

• Standard aggiunti
• Anche in questo caso possiamo distinguere due
  metodiche
• Metodo delle aggiunte standard o multiple
• Consiste nel preparare soluzioni dellanalita
  contenenti volumi noti e crescenti di soluzione
  standard della stessa specie da analizzare.
• Vi sono diversi modi per attuare il metodo delle
  aggiunte
• a) Introdurre una certa quantità di soluzione
  incognita in più matracci (3-4), aggiungere in
  ogni matraccio volumi diversi di soluzione
  standard (a concentrazione da 10 a 100 volte
  maggiore) e poi portare a volume con la soluzione
  incognita. Quindi di riportano in un grafico A/
  i valori ottenuti dalle diverse soluzioni.

Sol. STANDARD
1 mL
4 mL
3 mL
2 mL
1
2
4
3
102
A
A4
Cx sarà data dallintercetta sullasse delle x
(differenza tra i due zeri) cambiata di segno e
sarà inferiore rispetto alle concentrazioni degli
standard.
Y mx Y mx q
A3
A2
A1
A0
C agg
C1
C4
C2
C3
0
Cx
0
C1Cx
C3Cx
C4Cx
C2Cx
C eff
In realtà il metodo, rapido e pratico, non è del
tutto rigoroso, perché il contenuto di analita
varia leggermente allinterno delle diverse
soluzioni così come la concentrazione finale
dello standard aggiunto.
103

• Es. nel matraccio 1 abbiamo miscelato 99 mL a
  concentrazione Cx e 1 mL a concentrazione ad es
  1000 ppm, mentre matraccio 4 abbiamo miscelato
  96 mL a concentrazione Cx e 4 mL a concentrazione
  1000 ppm. Quindi gli incrementi effettivi
  differiscono leggermente.
• Infatti ammettendo che
• Cx 20 ppm e che 1 ppm 1 mg/L 1 mg/mL allora
  Cx 20 mg/mL
• Quantità dellanalita X nei diversi matracci
• 20 mg/mL . 99 mL 1980 mg 1,98 mg
• 20 mg/mL . 98 mL 1960 mg 1,96 mg
• 20 mg/mL . 97 mL 1940 mg 1,94 mg
• 20 mg/mL . 96 mL 1920 mg 1,92 mg
• Quantità dello standard aggiunto nei diversi
  matracci
• 1000 mg/mL . 1 mL 1000 mg 1,00 mg
• 1000 mg/mL . 2 mL 2000 mg 2,00 mg
• 1000 mg/mL . 3 mL 3000 mg 3,00 mg
• 1000 mg/mL . 4 mL 4000 mg 4,00 mg

104
Lincremento in termini di massa ad es per il
matraccio 1 è pari a 1 mg, ma in termini di
concentrazione sarà
(1,981,00) (mg)
(1000) (mL/L)
29,8 (mg/L o ppm)
(100) (mL)
(1,00) (mL) 1000 (mg/L)
10,0 (mg/L o ppm)
29,8-20,0 9,8 ppm e non 10 ppm
(100) (mL)
Lo stesso ragionamento può essere applicato ad es
al matraccio 4, il cui incremento in termini di
concentrazione sarà
(1,924,00) (mg)
(1000) (mL/L)
59,2 (mg/L o ppm)
(100) (mL)
59,2-20,0 39,2 ppm e non 40 ppm
Possiamo però calcolare lo scarto e vedere che
per ogni matraccio rimane costante
Matraccio 1
Matraccio 4
9,8-10
39,2-40
100
-2,0
100
-2,0
10
40
105
b) Per evitare lapprossimazione del metodo
precedente, si può aggiungere in ogni matraccio
un volume noto ed esatto Vx della soluzione
dellanalita a concentrazione incognita Cx e
aliquote (in mL) di soluzione standard crescenti
indicate con n1, n2, n3, ecc alla fine si porta
al volume finale Vt (ad es. 100 mL) con un
solvente opportuno.
A K Cni con K eb Cni concentrazione data
dal campione e da unaggiunta iesima dello
standard.
n1 Vx
n2 Vx
n3 Vx
n4 Vx
Vx Cx
ni Cs
A K

Vt
Vt
A
Y mx q
Cs
VxCx
A4
A K

ni
K
Vt
Vt
A3
Cs
VxCx
A2
A 0
0 K

K
nx
Vt
Vt
A1
Cs
Cx
(-nx)
A0
Vx
n1
n4
nX
n2
n3
106
Metodo delle aggiunte standard Vantaggi e
Svantaggi
N.B.
Permette di effettuare lanalisi quantitativa in
matrici complesse o incognite
Prima di effettuare la curva di taratura o di
applicare il metodo delle aggiunte è necessario
analizzare il bianco. Il bianco ideale è
costituito dalla soluzione conteente tutti i
componenti il campione ad eccezione dellanalita
stesso. In questo modo si può ottenere il segnale
relativo ad una concentrazione zero
dellanalita.
Si può applicare a tutte le tecniche analitiche
sia spettrofotometriche, elettrochimiche e
cromatografiche
E necessario un a curva di calibrazione per ogni
analita da determinare
E necessario un volume maggiore rispetto a
quello impiegato con la retta di taratura con
standard esterno
E un metodo per estrapolazione, teoricamente
meno preciso rispetto al metodo di interpolazione
della retta di taratura con standard esterno
E un metodo per estrapolazione, teoricamente
meno preciso rispetto al metodo di interpolazione
della retta di taratura con standard esterno
107

• Metodo dello standard interno
• Questo metodo viene usato prevalentemente in
  cromatografia. Consiste nel preparare una serie
  di soluzioni standard contenenti concentrazioni
  note e variabili dellanalita e le stesse
  quantità di unaltra sostanza (standard interno).
  Si costruisce una curva di calibrazione
  riportando in ascisse il rapporto ponderale o di
  concentrazione dellanalita e dello standard
  (Pa/Pis o X/IS) e in ordinate il rapporto
  delle aree (Aa/AIS).
• Quindi si aggiunge la stessa quantità di standard
  interno alla soluzione a concentrazione incognita
  e si effettua la determinazione.
• Dal rapporto delle aree si risale quindi tramite
  lequazione della retta al rapporto dei pesi o
  delle
• concentrazioni.
• Conoscendo la quantità
• di standard interno
• aggiunto, è possibile
• risalire alla quantità di
• analita.

a/IS
108
PA/PIS si ricava per interpolazione dal
grafico QIS è la quantità di standard interno
aggiunta (in peso)
Esempio Se la quantità di standard interno
aggiunta è 200 mg e il rapporto tra le aree
ottenuto dal cromatogramma è 1 per interpolazione
dal grafico precedente si ricava che il rapporto
PA/PIS risulta essere 1,25. Quindi dalla
relazione sopra citata ricaviamo che la quantità
di analita sarà 1,25 x 200 250 mg Se poi
vogliamo conoscere la concentrazione basta
considerare il volume di campione a cui è stato
aggiunto lo standard.
109

• Lo standard interno deve soddisfare certi
  requisiti
• Non essere presente nella miscela da analizzare
• Essere ben risolto dagli altri componenti
• Avere un tr diverso ma non troppo lontano da
  quello dellanalita
• Essere strutturalmente simile al composto da
  analizzare in modo che la risposta strumentale
  sia uguale o simile.
• Non contenere impurezze
• Non reagire con i vari componenti della miscela
  analizzata

110
Tipicamente i grafici dose/risposta approssimano
una linea retta Nella pratica, raramente tutti i
dati sperimentali sono allineati perfettamente
lungo una linea retta per questo occorre trovare
la retta migliore che interpola i punti
sperimentali attraverso unanalisi di regressione
lineare usando il metodo dei minimi
quadrati. Viene cioè calcolata lequazione della
retta che minimizza la somma dei quadrati delle
distanze verticali tra i punti e la retta
stessa. Lequazione è chiamata equazione di
regressione ed è del tipo y mx q dove m, il
coefficiente angolare, è chiamato coefficiente di
regressione. Tale retta, considerata la migliore,
passa anche per il centroide o centro di gravità
che corrisponde al punto (Xmedio, Ymedio), valori
corrispondenti ai valori medi di tutti i dati
sperimentali xi e yi.
Y
.
.
.
.
X
111
Per stabilire fino a che punto la retta trovata
possa essere usata al fine di prevedere un valore
di Y conoscendo un determinato valore di X, e
viceversa, cioè per stabilire se la retta è
realmente la migliore, si calcola il coefficiente
di determinazione o di correlazione lineare
r2. r2 può assumere valori in valore assoluto
compresi tra 0 e 1. Se r2 1 allora esiste una
relazione lineare perfetta tra x e y, per cui ad
ogni valore di x corrisponde uno e un solo valore
di y. Se r2 0 allora non esiste alcuna
relazione lineare tra x e y. Valori compresi tra
0 e 1 indicano la bontà dellequazione di
regressione calcolata. Difficilmente le rette di
calibrazione hanno valori di r2 inferiori a 0,98
e in ogni caso mai al di sotto dello 0,95.
112
Determinazione quali-quantitativa Resveratrolo
Famiglia Fitoalexine

• Forma trans
• Forma cis
• Forma glicosilata (3)

Antiossidante naturale presente nelluva, nel
succo duva e nel vino rosso

• GC-MS derivatizzazione con bis-(trimetilsilil)-tr
  ifluoroacetammide
• HPLC in fase normale con eluizione isocratica o
  in fase inversa con eluizione a gradiente
• Nel 1999 LC-MS (E.S.I.) in modalità di ione
  negativo (C18 eluente MeOH/CH3COONH4 (55/45
  v/v) 20mM)
• LC-MS (C.I.) in modalità di ione positivo (C18
  eluente MeOH/HCOOH) m/z229 MH

113
Spettro di frammentazione del resveratrolo
derivatizzato ottenuto per C.I. m/z 444 (10
mg/L)
Spettro di frammentazione del resveratrolo
ottenuto con electro spray ionization m/z
227 (200 pg/L)
114
Determinazione per HPLC-UV del trans e cis
resveratrolo in preparazioni commerciali e sua
stabilità alla luce e alla temperatura
-HPLC Gilson a due pompe con miscelatore -Colonna
C18 5 mM, lunghezza 250 mm, ID 4,6 mm -eluizione
isocratica -eluente miscela acqua/acetonitrile -Fl
usso 1 mL/min -Prove eseguite in
triplicato -Iniezione di 20 mL
Scelta della l analitica -Trans 306 nm e
320nm -Cis 295 nm
Ottimizzazione Acetonitrile
115
Conc. v/v T(min) T(min) T(min) media d.s. K log K
20 26,06 25,932 25,899 25,96 0,085 10,74 1,03
25 12,969 12,99 12,971 12,977 0,0116 4,87 0,69
30 7,915 7,926 7,924 7,922 0,00586 2,6 0,41
35 5,662 5,661 5,467 5,657 0,00839 1,56 0,19
40 4,528 4,493 4,501 4,507 0,0183 1,04 0,02
20 mL in triplicato di una soluzione preparata
diluendo 100 mL della soluzione Standard A in
matraccio da 100 mL (5,53 mg/mL) con
metanolo Soluz. Standard A 10,53 mg/10 mL
Area 1 Area 2 Area 3 Area 4 media µg/mL d.s. c.v.
73473 78487 78508 77971 77448,2 2.63 2242.241 2.9
176717 165339 181583 171204 173912.8 5.26 6086.796 3.49
256045 264057 232595 25