PENETRACI

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BASES MICROBIOLOGICAS DE LA TERAPÉUTICA Y LA
RESISTENCIA ANTIMICROBIANA Máster en
investigación médica, clínica y
experimental FARMACOLOGIA INTRACELULAR
DE ANTIMICROBIANOS Dra. Sofía Ballesta Mudarra
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Farmacología intracelular

• El objetivo del tratamiento antimicrobiano es
  concentrar en el lugar de la infección suficiente
  cantidad de antimicrobiano para inhibir o
  destruir al microorganismo
• En este sentido los parámetros
• PK/PD son predictivos del perfil
• farmacocinético son parámetros
• que correlacionan la eficacia
• frente a infecciones extracelulares
• Para patógenos intracelulares, el lugar donde
  debe concentrarse el antimicrobiano es menos
  accesible.

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Farmacología intracelular
Relaciones microorganismos y huésped
Intracelulares obligados. Adaptado a vivir
exclusivamente en el interior de las células y
necesitan estar en el interior de la célula para
sobrevivir Intracelulares facultativos pueden
residir tanto dentro como fuera. Intracelulares
oportunistas
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(No Transcript)
5
Farmacología intracelular
6
Farmacología intracelular
Intracellular drug concentrations
(review) Dollery, C.T. Clinical Pharmacology and
Therapeutics. 2013. Volumen 93, 263-266
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Farmacología intracelular
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Farmacología intracelular

• Vida intracelular
• Células fagocíticas
• Células no fagocíticas (epiteliales)
• La actividad intracelular va a depender de muchos
  factores, entre ellos
• de donde se localice la bacteria y
• de donde se acumule el antimicrobiano
• La célula con antibiótico intracelular se
  convierte en un transportador fisiológico al
  lugar de la infección

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Farmacología intracelular

• Factores de los que depende la penetración de los
  ATB en la cell
• Tipo de transporte que utilizan los ATB para
  entrar en la cell
• Localización intracelular de los ATB en la célula
• Elución del ATB desde el interior de la célula al
  medio extracelular
• Actividad intracelular del ATB
• Selección del ATB adecuado
• DISEÑO de moléculas nuevas

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Farmacología intracelular
Ci/Ce
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Farmacología intracelular

• Parámetros F-Q que rigen la penetración de ATB

• Lipofília P coeficiente de reparto
• Betelactámicos hidrófilos
• Quinolonas moderadamente lipofílicas
• Peso Molecular lt700 Da
• Capacidad de unión a proteinas
• Naturaleza acido-base de la molécula
• Ka pKa

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Farmacología intracelular

• Parámetros F-Q que rigen la penetración de ATB

• Naturaleza acido-base de la mólecula

Quinolonas (anfotéricas) Macrólidos (carácter
básico)
Betalactámicos (acidos orgánicos)
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Farmacología intracelular

• Mecanismo de penetración de ATB en la célula

Difusión pasiva

• Moléculas
• Neutras
• Lipófilas
• lt700 Da
• - Betalactámicos
• - Quinolonas

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Farmacología intracelular

• Mecanismo de penetración de ATB en la célula

• Moléculas
• (No neutras)
• Moléculas demasiados polares
• (ltlt700 Da)
• Moléculas demasiados voluminosas
• - Aminoglicosidos y
• - Glicopéptidos

Endocitosis
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Farmacología intracelular

• Mecanismo de penetración de ATB en la célula

Canales transportadores Activo
pasivo

• Moléculas
• Análogos de sustratos endógenos transportables al
  interior de la célula
• Con o sin Energía
• - Quinolonas y
• - Betalactámicos

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Farmacología intracelular

• Salida del ATB de la célula

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Farmacología intracelular

• Penetración intracelular de los ATB

• Aislamiento de células
• (PMN, Macrófagos, células epiteliales)
• Incubación células ATB
• Medir la concentración del ATB intracelular

célula eucariota
antimicrobiano
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Farmacología intracelular

• Penetración intracelular de los ATB

• Incovenientes
• Mide antimicrobiano asociado a la célula
  (fracción lipídica, proteica)
• antibiótico intracelular ó unido a la superficie
  externa de la célula.
• parte del antibiótico intracelular puede salir al
  exterior en el proceso

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Farmacología intracelular

• Penetración intracelular de los ATB

• Técnica cromatográfica
• V HPLC muy especifica
• I Requiere grandes volúmenes de células
• I Altas concentraciones de ATC
• Técnica radiométrica
• V Muy sensible y reproducible
• I ATB marcados radiactivamente
• Técnica fluorométrica
• V Muy sensible y reproducible
• I ATB con fluorescencia

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Farmacología intracelular

• Caracterización de la penetración de ATB

• Caracterizacion del paso por difusión pasiva
• Viabilidad celular
• Temperaturas
• Saturación del proceso
• Modificación del pH extracelular
• Caracterizacion del transporte activo
• Inhibidores metabólicos
• Inhibidores de fuentes de energía ( NaCN, FNa,
  2,4 dinitrofenol)
• Desacoplantes de potencial de membrana
  (ouabaína o CCCP)
• Ionóforos como el w-clorofenil hidrazona (CCP)
• Análogos del transporte
• Estimuladores celulares (PMA )
• Caracterizacion del efflux
• Inhibidores de bombas
• Distintos tiempos de incubación

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Farmacología intracelular

• Medida de la actividad intracelular

célula eucariota

• Medición de halos de inhibición del antibiótico
  del interior de las células
• 2. Medición de la reducción que se produce en
  la supervivencia intracelular de las bacterias

antimicrobiano
bacterias
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Diseño de nuevas moléculas.
Formulación de nuevos fármacos
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Fluorquinolonas

• Activos intracelularmente frente a patógenos
  intracelulares como Micobacteria, Legionella spp,
  Streptococcus pneumoniae y Sthapylococcus aureus.
• Mecanismos de resistencia específicos asociados
  con mutaciones, principalmente en los genes gyr A
  y parC.

UB-8902 . Esta molécula se diseña con objeto de
mejorar la actividad de ciprofloxacino y
norfloxacino frente a cepas resistentes.
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X R1 R2 R3 R4 R5 R6 Ciprofloxacino NH C3H5
H H H H - UB-8902 N C3H5 H H H H Met
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Objetivo

• Evaluar la penetración de UB-8902 en leucocitos
  polimorfonucleares hunanos (PMNs)
• Estudiar la actividad intracelular de UB-8902
  frente a S. aureus con resistecia asociada con
  mutaciones en los genes gyr A o parC

Strain Mutations Mutations Mutations
Strain gyrA Ser84 gyrA Glu88 grlA Ser80
5-61 wild-type wild-type wild-type
5-61 G8 wild-type wild-type mutant
5-61 M14 wild-type mutant mutant
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Cinética de penetración y eflujo de UB-8902

• Tras 20 minutos de incubación con concentración
  extracelular de 2 mg/mL se alcanzan
  concentraciones intracelulares de 13,5 mg/mL
  (C/E6.5).
• Tras cinco minutos de incubación en medio libre
  de antimicrobiano se libera el 70 del mismo
  desde el interior de los PMN.

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PENETRACIÓN DE UB-8902 EN PMN
Fluorquinolonas C/E
UB-8902 6.5
Norfloxacino 4.5
Lomefloxacino 6.9
Ofloxacino 6.6
Moxifloxacino 10
Trovafloxacino 10
28
La cantidad de UB-8902 asociado a PMNS se saturó
a concentraciones gt 50 mg/ML
29
Influencia de los factores ambientales
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Efecto de los estímulos de membrana
Conditions C/E
Control 6.5  0.8
2,4-Dinitrophenol 0.1 mM 7.4  1.1
Sodium cyanide 1.5 mM 3.3  1.4 a
Sodium fluoride 1.5 mM 5.6 1.8 
m-Chlorophenylhydrazone 0.015 mM 6.0  1.2
PMA 7.1  0.8
S. aureus 5-61 7.1  1.0
S. aureus 5-61 M14 6.9  1.6
a p lt0.05 compared with the control.
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Conditions/ Value UB 8902 Moxifloxacino DX 619 TROVAFLOX OFX LVX
Viable cells, 37ºC, pH 72 (control) 6.5  0.8 10 10 10 6.6 4.6
Viable cells, 4ºC ? ? ? ? ?
Dead cells, 37ºC ? ?
Eflujo Rápido Rápido Rápido Rápido Rápido Rápido
Saturabilidad 0-40 mg/L No No No No No No
pH 6 ? ? ? ?
pH 8 ? ? ? ?
2,4-Dinitrophenol 0.1 mM
Sodium fluoride 1.5 mM   ?
m-Chlorophenylhydrazone 0.015 mM ? ? ? ?
Hidrofobicidad Poco hidrofóbica Muy Hidrofóbica
Pasivo Activo Activo/pasivo Pasivo Activo /pasivo Activo /pasivo
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Actividad Intracelular de UB-8902
Cepa Mutaciones Mutaciones CMI CMI
Cepa gyrA Ser84 gyrA Glu88 grlA Ser80 UB 8902 Ciprofloxacino
   
5-61 wild-type wild-type wild-type 0,06 0,06
 
5-61 G8 wild-type wild-type mutant 0,5 8
 
5-61 M14 wild-type mutant mutant 4 64
La actividad de UB892 comparada con
ciprofloxacino se ve aumentada 16 veces
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• En la cepa salvaje, UB 8902 provocó una
  reducción significativa de la supervivencia
  intracelular con las tres concentraciones
  extracelulares ensayadas.
• En las cepas mutadas, solo produjo una reducción
  significativa de la supervivencia intracelular a
  con gt 1 mg/mL, no apreciándose diferencias
  significativas entre ambos tipos de cepas